论文部分内容阅读
临床化学毒物按照毒性为可分为剧毒、高毒、中毒、低毒和微毒五个等级,其数量庞大,仅剧高毒物质就有5000余种,种类繁多,涉及领域广泛。在我国,每年鼠药、农药、镇静催眠药、植物有毒成分等化学毒物的误服、蓄意投毒所造成的临床中毒事件屡有发生,对公共安全和人身健康造成极大威胁。化学毒物经过呼吸道、消化道及皮肤多种方式侵入机体,具有含量低、毒性高、病情发展快的特点,易造成主要生理功能障碍,引发多器官衰竭甚至死亡。临床化学中毒救治的首要前提是明确何种毒物中毒,以及中毒剂量、途径等,因此,发展快速、准确的临床化学毒物检测技术非常重要。干血斑(Dried Blood Spot,DBS)是一种先进的血液采集及保存方式,仅需将指尖或足跟血滴在滤纸卡上,常温下干燥2小时以上完成制备,具有操作简单、损伤小、便于运输和储存的优势,目前在临床快检方面备受重视,便于与多种分析检测技术,如液相色谱-串级质谱、甚至常压质谱等结合,从而实施临床中毒的快速检测和持续监测。其中,液相色谱-串级质谱技术可针对临床化学毒物检测浓度低、结构相似物繁杂及性质差异大等特点,以其高灵敏度和高选择性,为临床中毒快速诊断和救治提供可靠、快速的定性定量依据。针对干血斑中的临床化学毒物快速检测,如何实现普适、高效的样品提取,便成为方法发展中的决定性要素。另外,近年来备受关注的常压质谱,是一种在敞开式大气压环境中便可实施的直接、快速检测技术,可实现通量式质谱信息采集,以便满足临床多样本快速检测、诊断的需要。其中,低温等离子体(Low Temperature Plasma,LTP)离子化技术的构建较为简单、便捷,其等离子体温度低、且无需喷雾溶剂,利于实现机体的无损分析。LTP质谱和干血斑中的临床化学毒物快检是否能够成功对接?其难点则在于如何增强离子化,以及选择性地从复杂基质中检测出痕量分析物等方面。本研究针对临床干血斑样本,在重点考察滤纸卡种类、润湿步骤、提取溶剂种类基础上,建立了以水润湿、甲醇提取等普适的前处理方法,以霉酚酸作为内标,采用液相色谱-三重四级串联质谱(LC-QqQ-MS/MS)实现了对12种香豆素类和茚二酮类抗凝血杀鼠药的定性定量分析。结果表明,在提取过程中加入适量的水润湿滤纸卡,有助于目标化合物从纤维素链上游离出来并获得较高的提取回收率。DMPK-A、-B、-C和903四种滤纸卡对于抗凝血鼠药的干血斑分析存在差异,以903滤纸卡为基底时,各鼠药的提取率为66~115%,且结果稳定(日内RSD小于15%)。除杀鼠酮线性范围为20~500 ng/mL(R~2=0.9987)外,其它11种鼠药的线性范围为5~500 ng/mL(R~2=0.9988~0.9996);12种鼠药的回收率为61%~105%,基质效应在71%~193%(日内小于15%)。该方法准确、灵敏、快速且操作简便,已成功应用于临床实际中毒样本的检测,满足了临床中毒快检的需求,为抗凝血鼠药中毒的诊断救治提供可靠的新技术方法。在上述研究基础上,针对临床常见毒物秋水仙碱,建立以903滤纸卡为基底,采用水润湿、0.1%甲酸-甲醇提取的快速前处理方法,与液态血浆的处理过程相比,具有操作简单、用时短、提取效率高的优势。以瑞芬太尼为内标,采用LC-QqQ-MS/MS对秋水仙碱定性定量检测。经方法学验证,秋水仙碱的线性范围为2~100 ng/mL(R~2=0.9991),回收率在100~115%,基质效应为108~153%(日内小于15%),各项稳定性考察均符合方法学要求,RSD<15%。我们已将该方法成功应用于临床实际中毒样本的检测,包括血浆、尿液、骨髓及透析液废液。结果表明,干血浆斑与液态血浆的检测结果具有较好的一致性,并且秋水仙碱在各生物样本中的浓度与文献报道的分布情况一致,为临床秋水仙碱中毒的诊断提供可靠的新技术方法,指导临床救治工作。为实现临床干血斑样本的直接、实时检测,针对具有精神活性的芬太尼类药物,建立针对基于干血斑的低温等离子体-四级杆-飞行时间质谱(LTP-QTOF/MS)快速分析技术,并对提高离子化效率和纸基底修饰方法进行初步探究。先以咖啡因为模型化合物,分别针对性优化了LTP构建参数,确定的最优条件为,以铜丝作为外加电极,电极间距为3.5 cm,电压在2~2.5 kV,He气流速为0.25 L/min及探针到质谱进样口距离为2 cm。针对5种芬太尼类分析物,通过尖端套管对LTP探针进行结构改造,聚焦等离子体束,可以使芬太尼类化合物的信号增强2~3.5倍;另外,干血斑滤纸基底以含0.1%甲酸-甲醇浸润后可得到较佳的质谱响应,以石墨涂覆辅助激光照射有助于增加基底导电、导热性能,分析物信号提高1.4~2.2倍。分析物在解吸附后进入Q-TOF-MS/MS质谱分析器后,干燥气流速为影响质谱响应的主要因素,毛细管电压为800 V,干燥气流速为8 L/min,喷雾器压力为20 psig时,芬太尼类化合物质谱信号最高。目前5种芬太尼类化合物的LTP-QTOF/MS灵敏度为350 ng/mL,LTP-QTOF-MS/MS灵敏度略有提升,但仍比LC-QTOF MS/MS的灵敏度低1~2个数量级。预计下一步将从高功率激光辅助离子化、尾焰与源间距、尖端尾焰聚焦等多因素优化出发,及掺杂喷雾溶剂等提高离子化效率。