矽肺是由于长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘而引起的以肺间质纤维化为主要病变的全身性疾病,在我国属于法定职业病。1991～2002年我国职业病发病总数呈现明显的凹形反弹趋势。发病人数从20世纪90年代初的每年2.2万人逐步下降,1997年最低降至1万人后又呈反弹,2002年达1.5万人,其中主要是尘肺检出率显著回升,发病形势依然严重。卫生部公布的2006年全国共诊断各类职业病报告11519例,其中尘肺病8783例,占诊断职业病病例总数的76.25%。2006年职业病报告具有以下特点:尘肺病例比例增加,发病时间缩短,发病年龄趋于年轻化,未成年工职业健康损害严重。据不完全统计,截至2006年全国累计报告职业病676,562例,其中:尘肺病累计发病616,442例,死亡146,195例,现患470,247例;近15年平均每年新发尘肺病人近1万例。据报道,尘肺病每年对国家造成的直接经济损失约90亿元人民币,间接经济损失无法估计。而矽肺患者占了尘肺病例的近80%,表明矽肺是尘肺中危害最严重的职业病。而且,停止粉尘暴露,尘肺病依然进展;高浓度暴露,发病工龄缩短,发病年龄趋于年轻化,病情严重,死亡率高。并且,随着经济的发展,大量农村务工人员参与无防护措施的接尘工作,接触粉尘作业的人群还在急剧上升。ILO和WHO共同提出全球消除矽肺计划,在2010年使矽肺的发病率显著降低,到2030年完全消除矽肺。我国是尘肺大国,尘肺病人数、接触粉尘作业人数都居世界首位。直至目前,矽肺的发病机理仍然不完全清楚,无早期诊断的特异性指标。一经传统的后前位胸大片确诊,肺部病变已经无法逆转。而且也无特异性的治疗药物和方法,我国防治矽肺的药物主要有克矽平、磷酸喹哌、羟基喹哌、柠檬酸铝、矽肺宁、汉防己甲素以及某些中药等,但大多有一定的毒副作用。因此,研究矽肺早期病理机制,及寻找一种安全有效、低毒的新型抗纤维化药物,在矽肺病研究中已成为迫切需要解决的问题。研究目的为探讨矽肺发生及中药(手掌参)干预后的分子机制,以染矽尘大鼠为研究对象进行肺组织基因表达谱的比较分析,并初步对差异基因的功能进行探讨,以期从基因水平上揭示矽肺发生的分子机制,也为进一步探索更加有效、低毒的防治药物提供基础。研究方法2.1动物模型建立与处理本研究设定四个组,分别为对照组、染矽尘组、手掌参组(模型治疗组)和汉防己组(标准药物治疗组)。本研究采用SPF级近交群雄性Wistar大鼠,随机将大鼠分为四组,每组40只。染矽尘组与各治疗组采用气管暴露法,每只大鼠气管内注入浓度为50mg/ml的矽尘灭菌混悬液1ml,对照组注入0.9%NaCl注射液。染矽尘建模后第二天,手掌参组按手掌参提取物0.8g/100g的量给予,每天灌胃;汉防己组按汉防己甲素液5mg/100g的量给予,隔天灌胃;对照组、染矽尘组给予蒸馏水2ml,每天灌胃,如此直到将动物处死。以建模术时为0d记,模型建立后7d、14d、21d、28d和60d的5个时间点分别取8只大鼠处死,并将肺组织迅速投入液氮待用。采用HE染色和天狼猩红染色法,分别观察矽肺结节和Ⅰ、Ⅲ型胶原,并用Image-Pro Plus Version 4.5 for windowsTM图像分析系统对Ⅰ、Ⅲ型胶原进行定量。2.2基因芯片检测差异基因表达谱应用Illumina激光共聚焦光纤微珠基因芯片分析平台,经RNA扩增和标记、芯片杂交,并用BeadStation500激光共聚焦扫描系统进行扫描;用BeadStudio分析软件将扫描获取的荧光信号强度进行归一化处理,使用Illumina自行开发的算法求Diffscore值,比较一种基因探针在两种组织中的表达差异程度。采用DAVID生物信息学分析工具,采用Fisher精确概率检验,对差异基因的基因功能和生物学通路进行统计学富集分析。并用realrime-PCR的方法对差异基因进行验证。研究结果3.1染矽尘动物模型HE染色:在本次研究的各个时间点中,在注入矽尘后14d时动物出现明显变化,故本研究选用14d进行差异基因研究。主要表现为肺泡腔内肉芽肿进行性纤维化,成纤维细胞和平滑肌细胞增生并平行排列,肺泡壁增厚,可见胶原纤维积聚,肺泡结构破坏,出现斑片状纤维化。细胞结节数量多,体积大,可见巨噬细胞、浆细胞及反应性肺气肿。手掌参组HE染色结果介于矽尘组与对照组之间,肺泡炎和纤维化均有不同程度的减轻。3.2基因芯片检测筛选染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱本次芯片检测出的有效基因为22 107个,按照差异基因的筛选标准,筛选出染矽尘组与对照组的差异基因共1 567个,其中上调基因762个,下调基因799个。对基因功能进行分类,上调基因分为35个基因功能簇,下调基因分为20个基因功能簇,主要涉及:(1)细胞生命生化反应相关基因,包括细胞周期、细胞分化和增殖、细胞凋亡、细胞骨架、细胞信号转导、传递、氧化应激反应、DNA损伤应激反应、热休克蛋白等与毒性机制相关的基因;(2)与DNA、RNA和蛋白代谢,及与转录调节等生物过程相关的基因;(3)与氧化还原酶、氧化磷酸酶、水解酶、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶等分子功能相关基因;(4)以及细胞因子、趋化因子及免疫反应相关的基因等。按生物通路分析,萜类化合物、类固醇、ATP的生物合成、核黄素代谢等通路相关基因表达上调;而Wnt、TGF-β信号途径及淋巴细胞向内皮迁移通路相关基因表达下调。用real-time-PCR方法对SOD2和HMOX1基因进行验证,与基因芯片基因上调的趋势是一致的。3.3手掌参醇提取物对染矽尘早期大鼠肺组织差异基因表达谱的影响手掌参醇提取物对矽肺进程有逆转作用的差异表达基因共539个,其中上调基因308个,下调基因231个。按生物通路分析,与细胞粘附、Notch信号途径、淋巴细胞向内皮迁移、背腹轴形成、细胞通讯等通路相关的基因表达上调,与补体和凝血连锁、造血细胞系、尿素循环、阿耳茨海默病相关的基因表达下调。用real-time-PCR方法对SOD2和HMOX1基因进行验证,与基因芯片基因上调的趋势是一致的。研究结论本次芯片实验结果获取了染矽尘早期的差异基因表达谱,从生物信息学角度群体分析了差异基因表达谱,将众多与矽肺相关的基因分为若干功能相关的群体簇进行研究,这些差异基因主要涉及细胞周期、细胞分化增殖、细胞凋亡、细胞骨架、细胞信号转导、传递、氧化应激反应、DNA损伤应激反应、热休克蛋白等毒理相关基因;与DNA、RNA和蛋白代谢,及与转录调节等生物进程相关基因;与氧化还原酶、氧化磷酸酶、水解酶、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶等分子功能相关基因;以及细胞因子、趋化因子及免疫反应相关基因,由于篇幅所限,未对其一一进行讨论。差异基因功能分类的结果提示染矽尘早期可能存在复杂的基因调控网络。而手掌参提取物成分复杂,活性并不单一,可能多环节干预纤维化的形成,其作用机制可能是:(1)抗氧自由基;(2)抗RNS;(3)缓解血管损伤;(4)抑制淋巴细胞向内皮迁移。综上所述,本研究为进一步研究矽肺发病早期基因网络调控,发现手掌参的药靶基因及早期生物标志物提供了基础数据和研究方向。