由于非水相中生物催化的诸多优势，促进了耐有机溶剂酶类的研究和发展。然而多数耐有机溶剂微生物产酶量较低，限制了这类高性能的耐有机溶剂蛋白酶的使用，为了进一步开发并拓宽这类酶类的应用，基因工程的方法是一种有效的手段。本实验室在前期研究中筛选到一株产耐有机溶剂蛋白酶菌株Bacillus cereus WQ9-2，本论文在此基础上运用枯草芽孢杆菌体系中对该耐有机溶剂蛋白酶基因进行克隆表达，并进行工程菌的发酵产酶条件优化，并对其化特性进行初步探讨。主要研究内容如下:　　本研究在已筛选到的耐有机溶剂蛋白酶产生菌Bacillus cereus WQ9-2的基础上，经胰蛋白酶水解后的蛋白酶WQ片段进行LC/MS/MS检测分析，并对其结果进行氨基酸序列比对并设计引物扩增蛋白酶WQ基因。通过测序结果可知该基因片段大小为1701bp，序列经Blast比对表明该蛋白酶与Bacillus cereusATCC14579的芽孢菌粘素推测基因同源性为92％，其ORF区含有信号肽、前肽以及成熟肽的序列。同时，构建了用以表达的重组质粒pMA5/aprWQ，重组质粒不含目的基因的信号肽序列（穿梭载体pMA5自身携带信号肽），并转化至枯草芽孢杆菌宿主WB600中进行异源表达，重组菌的最高产酶量可达3770U/mL，重组菌分泌的蛋白酶经SDS-PAGE检测表明其分子量约为37kDa，与Bacillus cereus WQ9-2所产蛋白酶亚基分子量一致。经耐受性实验表明，重组酶在50％(v/v)的多种亲水性以及疏水性有机溶剂中表现出了良好的稳定性。　　本文通过单因素实验结合正交设计对重组菌产酶条件以及培养基进行优化，经优化后培养基成分为(w/v):胰蛋白胨2％，酵母粉3％，K2HPO40.3％，MnSO40.01％，CaCl20.1％，尿素1％，豆粕粉2％，玉米粉3％，发酵初始pH7.5;优化后的发酵条件为:发酵温度35℃，摇床转速为180r/min，接种量2％(v/v)，装液量为50mL/250mL。采用优化后的培养基以及培养条件进行发酵，最佳发酵时间为88h，其最大产酶量为可达20600U/mL，比野生型蜡样芽孢杆菌WQ9-2产酶量(3500U/mL)提高了6倍。研究了蛋白酶WQ催化羧基保护的Phe-NH2与几种氨基酸的小肽合成，利用pH有效调整底物与产物的溶解性能。实验表明，蛋白酶WQ高效催化合成了Z-Ala-Phe-NH2、Z-Asp-Phe-NH2、Z-Phe-Phe-NH2，其最高产率分别可达99％，68％,100％。综上所述，本研究首次克隆及表达了来源于Bacillus cereus WQ9-2的耐有机溶剂蛋白酶基因aprWQ。通过产酶条件优化使得重组菌WB600-pMA5/aprWQ产酶量大大提高，并初步探索其作为生物催化剂催化小肽合成的能力，为进一步发挥其高效生物催化作用等实际应用奠定了基础。