【摘 要】
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黄梁木是华南地区重要的速生用材树种,不仅生长速度快,而且材质细密。快速的次生生长主要依赖于维管形成层的细胞活性,包括形成层细胞增殖和形成层细胞分化。然而,木本植物次生生长与发育调控的分子机制还不清楚,特别是如何精准获取形成层细胞仍然是一道技术难题。因此,在精准捕获木本植物形成层细胞的基础上结合转录组差异表达分析挖掘参与次生生长与发育调控的关键功能基因,可以从分子水平解析木本植物次生生长与发育的调控
【基金项目】
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国家自然科学基金（30771759, 31170636,31470681）； 国家重点研发计划（2016YFD0600104）； 广东省自然科学基金重点项目（2016A030311032）； 广州市科技计划重大项目（201607020024）； 广东省林业科技创新
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黄梁木是华南地区重要的速生用材树种,不仅生长速度快,而且材质细密。快速的次生生长主要依赖于维管形成层的细胞活性,包括形成层细胞增殖和形成层细胞分化。然而,木本植物次生生长与发育调控的分子机制还不清楚,特别是如何精准获取形成层细胞仍然是一道技术难题。因此,在精准捕获木本植物形成层细胞的基础上结合转录组差异表达分析挖掘参与次生生长与发育调控的关键功能基因,可以从分子水平解析木本植物次生生长与发育的调控机理,对林木基因工程遗传改良具有重要意义。本研究以黄梁木幼苗为实验材料,通过石蜡切片体系优化和激光显微切割技术（LMD）参数调试,建立了黄梁木维管组织细胞LMD技术体系,精准获得不同时期的木质部、韧皮部和形成层细胞。经转录组测序（RNA-Seq）及数据分析获得其差异表达基因（DEGs）,并对其DEGs进行GO和KEGG功能富集分析,挖掘出参与黄梁木次生生长的关键基因,为林木的速生、优质性状的遗传改良提供理论基础。研究结果如下:1.确定了黄梁木初生生长向次生生长转换的节位。取黄梁木幼苗1-4茎节进行石蜡切片,通过番红对切片染色观察不同茎节间维管组织的发育情况。显微结构观察结果显示,第一茎节周缘维管束发育不完整,木质部和韧皮部组织仅2-3层细胞,为初生木质部（韧皮部）发育阶段;第二茎节周缘维管束基本形成,木质部和韧皮部组织加厚开始形成次生木质部和次生韧皮部,为初生生长向次生生长转换的过渡阶段;第三、四茎节周缘维管束发育完整,次生木质部和次生韧皮部结构完整,为次生生长阶段。2.建立了黄梁木维管组织细胞激光显微切割技术体系。从固定剂、脱水剂和透明剂的不同组合处理优化了黄梁木石蜡切片体系;从放大倍数、激光能量、切割孔径、切割速度等方面确定了黄梁木茎段不同维管组织细胞的切割参数。最终建立了黄梁木维管组织细胞激光显微切割技术体系,分别获得了形成层,韧皮部和木质部细胞并得到高质量RNA,满足后续RNA-seq分析的要求。3.经转录组测序分析,分别从黄梁木茎维管组织的次生木质部、次生韧皮部和形成层组织中筛选出803、109和1457个差异表达基因。在形成层差异表达基因中,WOX4.1和WOX4.2两个基因属于初生生长向次生生长转换时期特异表达的转录因子。4.黄梁木WOX基因家族鉴定和表达模式分析。从黄梁木全基因组中鉴定出19个WOX家族成员。其中,WOX4.1和WOX4.2在形成层中的表达显著高于木质部和韧皮部中的表达,WOX13.1和WOX13.2在形成层和韧皮部上调,在木质部表达相对较低。5.黄梁木WOX4.1、WOX4.2、WOX13.1和WOX13.2异源表达。克隆了黄梁木WOX4.1、WOX4.2、WOX13.1和WOX13.2四个基因全长及其启动子序列,以及拟南芥同源序列At WOX4/13基因的启动子,并分别构建了上述黄梁木四个基因自身启动子及拟南芥At WOX4/13启动子驱动对应基因的超表达载体,转化拟南芥,获得了转基因拟南芥T0代种子。
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