研究背景与目的变应性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)被认为是一个全球性的健康问题,导致巨大的社会负担。然而,AR的发病机制目前并没有完全阐明,对其治疗也并不十分理想,各种疗法均存在一定局限。因此,对AR早期预防方面的研究是目前的一个热点,生命早期变应原免疫干预是其中值得关注的一个方向。在临床实践中,变应原特异性免疫治疗通过变应原不同剂量刺激而实现。其中大剂量变应原可诱导良好的免疫耐受,而小剂量变应原则没有显著效果,提示不同剂量的变应原作用可产生不同的免疫效应。近年来,一些研究表明,生命早期的环境变应原暴露可能影响未来变应性疾病的发展。流行病学调查发现,生命早期高浓度的变应原暴露对将来变应性疾病发生可能具有保护作用,但具体机制却不明确,也缺乏这方面的研究。众所周知,变应原进入机体,首先为抗原呈递细胞(antigen-presenting cell, APC)所吞噬,加工处理成抗原肽的形式,将其呈递给初始T细胞,从而介导T细胞的分化。研究表明,树突状细胞(dendritic cell, DC)在受到外界刺激因素及局部微环境等的影响下,呈现不同的成熟分化状态。变应原的剂量差异亦有可能作为一种外界干扰因素,对DC成熟状态造成影响。而最新的一些研究也表明,DC的不同成熟状态对T细胞分化方向可有极大影响。因此,我们认为DC可能在生命早期变应原干预中扮演关键角色。在我们的设计中,变应原剂量作为唯一的差异因素,所形成的T细胞免疫记忆方向却不同。而变应原只可能先通过DC的抗原呈递作用,才能触发后续的反应。因此极有可能是不同剂量变应原免疫干预后,通过影响DC的不同成熟状态,进而对T细胞分化方向及后期的免疫效应造成影响。鼻腔黏膜中含有丰富的APC(主要是DC)和CD4+T辅助细胞,而目前认为AR的发病机制与T细胞相关亚群功能平衡失调密切相关。因此,DC作为体内最重要的APC,在AR的发病机制中必然占有非常重要的地位。在生命早期高浓度变应原暴露可能具有保护作用这一现象基础上,我们设想在生命早期予以一定剂量变应原主动免疫干预,使机体产生免疫保护作用,从而特异性地预防相应变应原后期接触致敏,抑制AR的发生。本文将在动物实验中探索不同剂量卵清蛋白(OVA)早期致敏小鼠对其成年后免疫功能的影响,然后在体外试验中研究不同剂量OVA对DC成熟状态的影响及此后对初始T细胞分化方向的影响,从而为生命早期变应原干预提供理论基础。方法1.不同剂量OVA刺激幼年小鼠对其成年时免疫状态的影响BALB/c乳鼠出生后的第1、8、15天给予不同剂量OVA (10μg、1000μg)致敏,第5周OVA激发,一周后处死获取标本。设对照组,致敏用生理盐水或氢氧化铝,激发用生理盐水。ELISA检测血清中OVA特异性IgE、IgG1和IgG2a水平以及脾单个核细胞培养上清中IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。2.不同剂量OVA对树突状细胞成熟状态的影响BALB/c雌性小鼠,获取骨髓细胞,在体外用GM-CSF+IL-4联合诱导培养骨髓源性树突状细胞(BMDC)。培养至第六天,用不同剂量OVA(0、0.1、1、10、100、1000、10000μg/m1)刺激,继续培养24小时,收集悬浮和半贴壁细胞,流式细胞术检测其中DC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和主要组织相容性复合物分子Ⅱ(MHC Ⅱ)的表达水平。3.树突状细胞的成熟分化状态对初始T细胞分化方向的影响BALB/c雌性小鼠,获取骨髓细胞,在体外用GM-CSF+IL-4联合诱导培养BMDC。培养第六天,用不同剂量OVA (010、1000、10000μg/ml)刺激未成熟树突状细胞,继续培养24小时。取BALB/c雌性小鼠淋巴结,磁珠分选获得初始T细胞。收获树突状细胞,与分选之初始T细胞混合培养72小时,流式检测各组CD4+Foxp3+, CD4+T-bet+和CD4+Gata3+细胞比例。结果1.不同剂量OVA刺激幼年小鼠对其成年时免疫状态的影响不同剂量OVA早期致敏小鼠后,6周龄时小剂量组小鼠血清中OVA特异性IgE明显高于对照组和大剂量组：大剂量组OVA特异性IgE与对照组间无显著性差异。小剂量组血清OVA特异IgGl相对高于大剂量,而OVA特异性IgG2a则相对低于大剂量组。同时,脾单个核细胞培养上清中细胞因子检测发现,小剂量组IFN-γ/IL-4比值低于对照组,呈现明显的Th2方向反应,而大剂量组中则表现为Thl方向:IFN-γ/IL-4明显高于对照组。2.不同剂量OVA对树突状细胞成熟状态的影响培养6天后,CDllc+细胞比例均大于80%。OVA刺激24小时后,OVA剂量为0、0.1、1和10μg/ml,树突状细胞成熟表型CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ均无明显差异。但当OVA剂量达到100及以上时,各表型表达均明显提高,且均随剂量增大而提高。3.树突状细胞的成熟分化状态对初始T细胞分化方向的影响分选细胞中,CD4+CD62L+细胞比例均大于92%。混合淋巴细胞培养72小时后发现：0和10μg组CD4+Gata-3+细胞比例明显较高；1000μg组CD4+T-bet+细胞比例明显较高；而10000μg组CD4+Foxp3+细胞比例明显增高,CD4+Gata-3+和CD4+T-bet+细胞比例则均明显下降。结论总之,我们在动物模型中发现：新生小鼠给予小剂量OVA刺激时,成年后表现出Th2优势的免疫反应；而大剂量OVA刺激时,则形成Thl优势的免疫反应。体外实验发现：在一定范围内,不同剂量的OVA刺激DC形成不同的成熟状态,从而促使初始T细胞向不同的方向分化。我们的发现证实了生命早期高浓度变应原暴露具有保护作用的观点,更进一步揭示了生命早期大剂量变应原干预产生保护作用的靶点可能在DC上,为变应性鼻炎等变应性疾病的防治提供了新的启示。