本研究基于"方证相关"理论,以肝郁证、泌乳素与神经-内分泌-免疫网络三者之间的关联性和柴胡疏肝散对肝郁证的疗效为立论前提,根据中医病因学及发病学的原理复制了肝郁证大鼠模型,以中医肝郁证存在免疫系统和PRL异常及PRL可能参与其免疫功能调节为问题切入,探查不同时间点的免疫功能状态、PRL及其相关调节因素的变化,以从泌乳素神经-内分泌-免疫关联的角度探讨中医肝郁证的现代内涵。在此基础上,以"肝郁证-PRL-细胞免疫-分子信号通路"之间的关联为切入,从系统生物学和分子生物学角度,探讨肝郁证模型泌乳素—免疫细胞功能—泌乳素受体及其信号通路关联蛋白和目的基因的变化上,探查柴胡疏肝散、氟西汀和溴隐亭对模型上述环节的干预效应。论文分为文献综述和实验研究两部分。文献研究主要是对肝郁证及其现代神经-内分泌-免疫学内涵和泌乳素免疫调节作用的实验和临床研究进展进行了综述。实验研究包括研究一和研究二两部分,研究一侧重探查不同时间点肝郁证神经内分泌免疫状态及泌乳素分泌水平的变化;研究二重点探查肝郁证高泌乳素血症神经-内分泌-免疫异常机制及柴胡疏肝散作用。研究一 肝郁证模型大鼠的免疫功能状态及泌乳素变化方法:大鼠随机分为正常对照组、肝郁模型组。模型组按慢性束缚制模方法处理,连续28d;分别于造模第15d、22d、29d,腹主动脉取血,低温取下丘脑;酶免法测定血清NE、E、IL-2、IL-6、γ-IFN、TNF-α,下丘脑5-HT、DA;放免法测定下丘脑TRH、血清CORT,PRL;流式细胞仪法测定CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T。各组指标数据均以(x±s)表示,数据符合正态分布采用独立样本t检验。结果:造模两周后,模型大鼠开始出现易怒烦躁,并逐渐转为情绪低落、表情淡漠和争斗减少,伴见饮食减少,大便较干;与正常组相比,模型大鼠2W末、3W末、4W体重均见明显降低(P<0.01);模型大鼠2W末、3W末、4W活动状态和情绪睡眠积分明显增加(P<0.05或P<0.01)、4W末皮肤毛发积分值明显增加(P<0.05);模型大鼠2W末、4W末糖水偏嗜量明显降低(P<0.01)。模型大鼠2W末血清NE、E、CORT、PRL、TNF-α、γ-IFN、CD3、CD4含量明显增加,血清IL-6含量和下丘脑5-HT、DA含量明显降低(P<0.05或P<0.01);3W末、4W末血清NE、E、CORT、PRL含量和下丘脑5-HT和TRH含量明显增加,血清IL-2、IL-6、TNF-α、γ-IFN、CD3、CD4、CD4/CD8含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。研究二肝郁证模型大鼠高泌乳素及神经-内分泌-免疫机制和相关方药的作用方法:大鼠随机分成正常组、肝郁组、柴胡疏肝散大剂量组、柴胡疏肝散小剂量组、溴隐亭组、氟西汀组。实验期间观察并记录各组大鼠每周外观行为和体重的变化。模型组分别按上述方法造模,连续28d;于造模第15d,西药组分别给予溴隐亭0.22mg/kg·d灌胃,氟西汀1.8mg/kg·d灌胃;中药大剂量组大鼠给予柴胡疏肝散颗粒1.24g/kg· d灌胃,小剂量组大鼠给予柴胡疏肝散颗粒0.31g/kg·d灌胃,1次/d,连续14d。实验第29d,腹主动脉取血,低温取下丘脑和垂体。酶免法测定血清NE、E、IL-2、IL-6、γ-IFN、TNF-α,下丘脑5-HT、DA;放免法测定下丘脑TRH、血清CORT,PRL;流式细胞仪法测定CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T。蛋白免疫印迹法测定T淋巴细胞STAT5、PRLR蛋白表达;实时荧光定量PCR法测定T淋巴细胞IRF-1基因表达;免疫荧光法测定垂体PRL蛋白表达。各组指标数据均以(x土s)表示,采用单因素方差分析(one-wayANOVA)后,行多组间比较,采用LSD检验。结果:造模两周后,模型大鼠开始出现易怒烦躁,并逐渐转为情绪低落、表情淡漠和争斗减少,伴见饮食减少,大便较干;与正常组比较,模型大鼠1W末、2W末、3W末、4W体重均见明显降低(P<0.01);模型大鼠2W末、3W末、4W活动状态和情绪睡眠积分明显增加(P<0.05或P<0.01)、4W末皮肤毛发积分值明显增加(P<0.05);模型大鼠2W末、4W末糖水偏嗜量明显降低(P<0.01);模型大鼠2W末爬行格数、直立次数、中央格停留时间、里程数均明显升高(P<0.01),修饰次数明显降低(P<0.01),4W末爬行格数、直立次数、修饰次数、里程数均明显降低(P<0.05或P<0.01),中央格停留时间明显升高(P<0.01);模型大鼠4W末血清NE、E、CORT、PRL含量、下丘脑5-HT和TRH含量和垂体PRL表达量明显增加,血清IL-2、IIL-6、TNF-α、γ-IFN、CD3、CD4、CD4/CD8含量、T淋巴细胞STAT5蛋白、PRLR蛋白和IRF-1 mRNA表达量明显降低(P<0.05 或 P<0.01)。给药2W后,柴胡疏肝散大剂量组大鼠情绪改善明显,活动稍增多,饮食有所增加；柴胡疏肝散小剂量组和溴隐亭组大鼠无明显变化;氟西汀组大鼠情绪改善明显,活动和饮食增多,扎堆倦卧减少,皮肤毛发明显改善。与肝郁模型组比较,柴胡疏肝散大剂量组大鼠体重、糖水偏嗜度、爬行格数、里程数以及血中IL-2、IL-6、TNF-α、γ-IFN、CD3+T淋巴细胞数、CD4+T淋巴细胞数、CD4/CD8T淋巴细胞数、T淋巴细胞STAT5蛋白、PRLR蛋白和IRF-1mRNA表达量均明显升高,活动行为积分值、情绪睡眠积分值、皮肤毛发积分值、中央格停留时间以及血中NE、E、CORT、PRL和下丘脑5-HT、TRH、垂体PRL的表达均明显降低(P<0.05或P<0.01);氟西汀组大鼠体重、糖水偏嗜度、爬行格数、修饰次数、里程数以及血IL-6、TNF-α、γ-IFN、CD4/CD8T淋巴细胞数明显升高,活动行为积分值、情绪睡眠积分值、皮肤毛发积分值和中央格停留时间以及血NE、E、CORT、PRL、垂体PRL和T淋巴细胞的IRF-1 mRNA表达量明显降低(P<0.05或P<0.01);溴隐亭组大鼠血PRL、下丘脑TRH和垂体PRL的表达明显降低,血IL-6、CD3、CD4和CD4/CD8T淋巴细胞数、T淋巴细胞STAT5蛋白、PRLR蛋白和IRF-1 mRNA表达量均明显升高(P<0.05或P<0.01)。与柴胡舒肝散大剂量比,氟西汀组大鼠情绪睡眠积分值、爬行格数、里程数、外周血CD3、CD4、CD4/CD8T淋巴细胞数目、T淋巴细胞PRLR蛋白、STAT5蛋白及IRF-1 mRNA表达量明显降低,中央格停留时间、糖水偏嗜量、明显升高(P<0.05或P<0.01);柴胡疏肝散小剂量组大鼠活动状态、情绪睡眠积分值、中央格停留时间、血清PRL和下丘脑TRH均明显升高,糖水偏嗜量、爬行格数、里程数、血清IL6、外周血CD3、CD4、CD4/CD8T淋巴细胞数目和T淋巴细胞PRLR蛋白、IRF-1 mRNA表达量均明显降低(P<0.05或P<0.01);溴隐亭组大鼠在活动状态、情绪睡眠积分值、下丘脑5-HT含量均明显升高,糖水偏嗜量、T淋巴细胞PRLR蛋白表达量明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:肝郁证模型大鼠存在持续性泌乳素升高、HPA轴亢进及神经内分泌免疫的异常(中枢单胺类递质出现先降低逐渐回升,免疫功能先升高后降低),其机制涉及到T细胞及其JAK-STAT信号通路的传导异常,其中过高的PRL引起的T细胞膜上的PRL受体表达降低是其重要的调控环节。另外,肝郁证免疫功能降低可能还涉及到HPA轴的亢进,其确切的调控机制仍待进一步探查。柴胡疏肝散对该模型大鼠的肝郁证候和西医(神经内分泌免疫系统)病生理指标均有良好的改善作用;氟西汀对该模型大鼠的肝郁证候有改善作用,对其中神经内分泌部分指标有改善作用,对免疫功能的改善作用不明显;溴隐亭对肝郁证候无明显作用,对高泌乳素血症及免疫功能有一定的改善作用。较之于西药,中医因证治方具有整体和多环节调节作用优势。肝郁模型大鼠存在"PRL-免疫系统-T细胞-JAK-STAT"调节异常,中药柴胡疏肝散和西药溴隐亭对模型大鼠免疫功能均有改善作用,其机制均涉及PRL中枢调节及T细胞PRL-JAK-STAT信号通路的调节。氟西汀对肝郁证免疫系统的调节可能不涉及T细胞JAK-STAT信号通路。推测PRL的升高不仅是慢性应激肝郁证神经内分泌免疫功能异常的部分生物学基础,也是柴胡疏肝散方作用于肝郁证的重要分子靶标。