论文部分内容阅读
α-synuclein蛋白(SNCP)广泛存在于大脑组织中,是一种脂结合的突触前蛋白。越来越多的研究发现α-synuclein是一些神经退行性疾病共同的致病因子,它以聚集纤维的状态在神经元或神经胶质细胞中沉积是这些神经退行性疾病的标志,这些疾病包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、Lewy小体痴呆、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和多系统萎缩症(multiple system atrophy,MSA),它们通称Synucleinopathies。微管是细胞骨架的主要结构,由a/βtubulin异二聚体和许多小的微管相关蛋白组成(MAPs),MAPs对细胞中微管的动力调节和分布起重要的作用,且微管在维持细胞的形态、细胞内物质运输以及细胞的有丝分裂和减数分裂过程中起非常重要的作用。α-synuclein蛋白作为一种功能性的微管相关蛋白,明确它与微管蛋白之间的相互关系,为进一步研究该蛋白的结构和功能以及理解其在神经系统疾病中的作用有着重要意义。在本研究中,我们利用原核表达系统纯化出全长的SNCP,同时从牛脑组织中提取纯化的天然微管蛋白,通过免疫共沉淀、GST pull-down等技术证明全长的SNCP能够在体外与天然的微管蛋白发生分子间的相互作用,并且利用免疫荧光共聚焦显微镜发现二者共定位于细胞中,为证实二者在细胞中的相互作用提供了理论依据;为了进一步明确SNCP与微管蛋白发生相互作用的区域,我们构建并表达了SNCP的缺失突变体SNCP1-60、SNCP60-100、SNCP31-100和SNCP1-100,通过免疫共沉淀、GST-pull down等技术研究它们与天然微管蛋白的相互作用,研究发现SNCP60-100、SNCP31-100和SNCP1-100能够与微管蛋白之间发生分子间的相互作用,而SNCP1-60与微管蛋白之间则不存在相互作用,初步确定SNCP与微管蛋白的相互作用位点位于SNCP60-100 aa,但不排除SNCP60-100 aa也有作用位点存在。在证实SNCP与微管蛋白间存在体外的分子间相互作用并确定二者相互作用区域的基础上,我们进一步利用体外微管聚集实验和共沉淀实验检测SNCP与tubulin的相互作用是否对微管的聚合产生影响。结果显示,全长的SNCP能够影响微管蛋白的聚合,而N端的SNCP1-60对微管蛋白的聚合影响不明显,SNCP60-100、SNCP31-100和SNCP1-100与全长的SNCP同样,能够对微管蛋白的聚合造成影响。提示SNCP蛋白能够影响微管蛋白的聚合,且对微管蛋白的聚合造成影响的序列主要位于60位氨基酸之后的区域。