论文部分内容阅读
植物病毒病是农业上十分严重的病害，往往给农作物产量造成巨大的损失。近年来，微生物源抗病毒物质以其特有的优势成为抗病毒药剂筛选中的一个热点。ZX01菌株(Streptomyces sp.)是由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心分离自新疆喀纳斯湖湿地土壤的一种链霉菌。前期研究表明，ZX01菌株发酵液具有明显的抗TMV活性。为明确链霉菌ZX01次生代谢产物中抗TMV活性成分，本研究以心叶烟(Nicotianaglutinosa L.)和中烟102为寄主材料，以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)为供试毒源，采用活性跟踪法和现代分离技术手段，初步对链霉菌ZX01发酵液中的抗TMV活性成分进行了研究，主要得出以下结果:(1)首先采用大孔吸附树脂对链霉菌ZX01发酵液中抗TMV高活性成分进行富集，其中50%甲醇洗脱段抗TMV活性最高，在10mg/mL时，体外钝化活性达95.94%；对50%甲醇洗脱段进行萃取分离，经活性测定表明，活性成分主要集中在水相；采用薄层层析、离子柱层析和透析等方法对水相部分进行纯化，并结合核磁(氢谱)分析，发现抗TMV活性成分的分子量大于3000，且氢谱图上的质子共振峰符合糖类物质的特征。因此，推断链霉菌ZX01发酵液中抗TMV活性成分为大分子糖类物质。(2)链霉菌ZX01发酵液经乙醇沉淀和sevage除蛋白后，得到较纯的胞外粗多糖；胞外粗多糖经DEAE离子柱层析分离，获得4个洗脱组分EPS-0、EPS-1、EPS-2和EPS-3。活性测定表明，胞外粗多糖在0.5mg/mL时，对TMV体外钝化活性为81.32%，初侵染抑制活性为63.77%，抑制复制增殖活性为72.88%；在5mg/mL时，DEAE4个洗脱组分中EPS-0无明显抗TMV活性，其余三个洗脱组分中EPS-2活性最好，体外钝化活性和初侵染抑制活性分别为66.36%和48.26%。(3)采用硫酸苯酚法和考马斯亮蓝法测定结果表明，链霉菌ZX01次生代谢物中胞外粗多糖总糖的含量为51.83%，胞外粗多糖结合蛋白含量为12.29%；EPS-2的糖含量为69.83%，EPS-2结合蛋白含量为5.34%。二者经紫外光谱分析，在260nm和280nm下均未见核酸和游离的蛋白特征吸收峰。EPS-2经高效液相色谱检测，呈现出单一对称峰；经红外光谱和1H NMR分析，其具有明显的多糖特征吸收，且主要糖苷键为α型。(4)采用常量喷雾法、灌根法和喷雾+灌根法3种施药方式对链霉菌ZX01发酵液进行抗TMV效果测定。结果表明，链霉菌ZX01发酵液以喷雾+灌根方式施药效果最好，41d后的预防效果为31.81%，优于对照药剂吗啉呱·乙铜500mg/L的处理。胞外粗多糖在浓度为200mg/L时，41d防效为33.53%，与发酵液喷雾+灌根处理效果相当。