【摘 要】
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人溶菌酶（human lysozyme, hLYZ）是一种碱性球蛋白,在人的体液、细胞和组织中分布广泛。人溶菌酶能够参与机体多种免疫反应,是人体内一种重要的防御因子,具有抗菌消炎等作用,增强机体抵抗力。但是天然人溶菌酶的提取比较困难,成本较高。本研究利用乳腺生物反应器来表达重组人溶菌酶,其关键在于高效表达载体的制备。本研究采用连续三步基因抓捕法,用人LYZ基因组序列,从翻译起始位点（ATG）到翻译
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人溶菌酶（human lysozyme, hLYZ）是一种碱性球蛋白,在人的体液、细胞和组织中分布广泛。人溶菌酶能够参与机体多种免疫反应,是人体内一种重要的防御因子,具有抗菌消炎等作用,增强机体抵抗力。但是天然人溶菌酶的提取比较困难,成本较高。本研究利用乳腺生物反应器来表达重组人溶菌酶,其关键在于高效表达载体的制备。本研究采用连续三步基因抓捕法,用人LYZ基因组序列,从翻译起始位点（ATG）到翻译终止位点（TAA）将mWAP基因座中乳清酸蛋白的基因组序列完全置换掉,从而构建"mWAP5’端调控序列-hLYZ-mWAP3’调控序列”的乳蛋白杂合基因座表达载体。所构建的乳蛋白杂合基因座表达载体,使人LYZ在体内表达时自动获得mWAP上完整的表达调控序列和调控元件。首先,将预先合成的六个抓捕同源臂序列插入到pBR322载体的酶切位点中,构成能够连续进行三次基因抓捕的重组载体。在大肠杆菌体内利用入噬菌体Red重组系统介导的同源重组方法,分三步完成目的基因片段的抓捕。第一步,从含小鼠乳清酸蛋白基因座的BAC上抓捕了7.2Kb大小的mWAP基因的3’端调控序列；第二步,从含hLYZ基因座的BAC上抓捕了4.3Kb大小的hLYZ基因组序列；第三步,从含小鼠乳清酸蛋白基因座的BAC上抓捕了8.6Kb大小的mWAP基因5’端完整调控序列,最后获得一个全长约28Kb的" pBR322-5’m WAP-hLYZ-3’m WAP "乳蛋白杂合基因座。然后通过限制性内切酶酶切去掉原核载体部分,即获得长约22kb的"5’mWAP-hLYZ-3’mWAP"乳蛋白杂合基因座。此法将为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法,同时也为人溶菌酶的生产提供了一条可选择的途径。将构建的"mWAP-hLYZ"乳蛋白杂合基因座通过显微注射法整合到小鼠的受精卵中,制备转基因动物。通过PCR技术和Southern-blot鉴定,获得了七个转基因小鼠系。再经western-blot鉴定证实,人溶菌酶在转基因小鼠乳汁中获得高效表达,而且重组人溶菌酶具有特异性。研究结果表明：所构建的"mWAP-hLYZ"乳蛋白杂合基因座可以在转基因小鼠模型上有效地表达重组人溶菌酶,这为大型动物乳腺生物反应器的制备奠定了基础。
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