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目的:肺癌的发病率和死亡率目前仍高居不下,肺腺癌是肺癌的主要类型之一。有氧糖酵解是肿瘤特有的获取能量的方式。近年来,靶向肿瘤糖酵解的治疗备受关注。肿瘤氧化应激微环境中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）与糖酵解之间存在分子串扰。NADPH氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH oxidase,NOX）是肿瘤细胞产生活性氧的主要来源,NADPH氧化酶4（NOX4）是NADPH氧化酶的一个重要活化亚型。课题组前期研究发现NOX4与肿瘤糖酵解和增殖迁移密切相关。本研究旨在探讨肺腺癌糖酵解调节分子c-MYC与氧化应激关键分子NOX4之间的调控关系,并深入研究其影响肿瘤增殖和迁移生物学行为的分子作用机制。研究方法:培养人肺腺癌H1299,A549和人正常支气管上皮细胞HBE。通过细胞瞬时转染的方法转染si c-MYC构建c-MYC沉默细胞系,利用q RT-PCR方法检测NOX4,miR-19b-1-5p,Western Blot方法检测NOX4表达水平变化。通过细胞瞬时转染的方法转染miR-19b-1-5p mimic和miR-19b-1-5p inhibitor,并与c-MYC和NOX4对应的si RNA和过表达质粒共转染,利用q RT-PCR方法检测NOX4水平,利用Western Blot方法检测NOX4,c-MYC,糖酵解相关指标（HK2,LDHA,PKM2和PKLR）AKT/p-AKT水平变化;通过流式细胞仪检测活性氧ROS水平;利用EDU试剂盒测定细胞的生长能力,利用划痕和Transwell实验测定细胞的迁移能力。通过双荧光素酶实验验证miR-19b-1-5p与NOX43’UTR之间存在靶向结合。通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验验证c-MYC可结合miR-19b-1-5p启动子区。利用裸鼠皮下移植瘤实验、18F-FDG micro PET显像和免疫组化染色技术检测裸鼠移植瘤的糖代谢水平及糖酵解等相关指标。结果:1.通过qRT-PCR和Western Blot检测NOX4的表达,发现沉默c-MYC可抑制NOX4的m RNA和蛋白表达水平。2.TransmiR数据库提示在肺组织中c-MYC可作为转录因子结合miR-19b-1-5p启动子区实现转录调控。通过q RT-PCR检测在上下调c-MYC后miR-19b-1-5p的表达水平,结果显示c-MYC负调控miR-19b-1-5p表达。3.在H1299和A549细胞共转染c-MYC OE+miR-19b-1-5p mimic和si c-MYC+miR-19b-1-5p inhibitor,利用流式细胞仪检测活性氧ROS水平,结果显示miR-19b-1-5p mimic可回复过表达c-MYC对肺腺癌细胞ROS水平的促进作用,miR-19b-1-5p inhibitor可回复沉默c-MYC对肺腺癌细胞ROS水平的抑制作用。利用18F-FDG摄取实验和乳酸检测试剂盒检测细胞摄取葡萄糖能力和乳酸代谢累积含量,结果显示miR-19b-1-5p mimic和miR-19b-1-5p inhibitor可回复过表达c-MYC对肺腺癌细胞18F-FDG摄取率和乳酸生成的促进作用及沉默c-MYC对肺腺癌细胞18F-FDG摄取率和乳酸生成的抑制作用。通过q RT-PCR和Western Blot检测糖酵解关键酶HK2,LDHA,PKM2和PKLR的表达,结果显示miR-19b-1-5p mimic和miR-19b-1-5p inhibitor可回复过表达c-MYC对糖酵解关键酶的上调效果及沉默c-MYC对糖酵解关键酶的下调效果。4.根据生物信息数据库预测的c-MYC和miR-19b-1-5p结合位点序列设计四条q PCR引物,分别在H1299和A549细胞中,利用Ch IP-q PCR实验检测c-MYC结合的DNA片段,结果显示c-MYC可结合miR-19b-1-5p mimic启动子区特定序列,其中primer3和primer4对应的结合位点效果最为显著,其对应预测的结合位点序列为GATGTGCT。5.Starbase数据库提示miR-19b-1-5p和NOX4在肺腺癌中的表达呈负相关。在H1299和A549细胞共转染miR-19b-1-5p mimic+NOX4 OE和miR-19b-1-5p inhibitor+si NOX4,通过Western Blot检测NOX4和糖酵解关键酶HK2,LDHA,PKM2和PKLR的表达,结果显示miR-19b-1-5p mimic抑制NOX4和糖酵解关键酶的表达,抑制miR-19b-1-5p可上调NOX4和糖酵解关键酶的表达。NOX4 OE可回复miR-19b-1-5p mimic对糖酵解关键酶表达的抑制作用,si NOX4可回复miR-19b-1-5p inhibitor对糖酵解关键酶表达的上调作用。利用18F-FDG摄取实验和乳酸检测实验,结果显示NOX4OE可回复miR-19b-1-5p mimic对肺腺癌细胞18F-FDG摄取率和乳酸生成的促进作用,si NOX4可回复miR-19b-1-5p inhibitor对肺腺癌细胞18F-FDG摄取率和乳酸生成的抑制作用。活性氧检测实验发现miR-19b-1-5p mimic降低ROS水平,而miR-19b-1-5p inhibitor升高ROS水平,NOX4可回复该作用。利用EDU试剂盒测定细胞生长能力,利用划痕和Transwell实验测定细胞迁移能力。结果显示miR-19b-1-5p mimic抑制细胞的增殖和迁移能力,抑制miR-19b-1-5p可促进细胞的增殖和迁移。NOX4 OE可回复miR-19b-1-5p mimic对对细胞增殖和迁移的抑制作用,si NOX4可回复miR-19b-1-5p inhibitor对细胞增殖和迁移的促进作用。双荧光素酶试验结果显示miR-19b-1-5p mimic可结合野生型NOX4 3’UTR区实现负调控NOX4的功能。6.在H1299,A549细胞系转染c-MYC OE,c-MYC OE+miR-19b-1-5p mimic和Vector,利用q RT PCR检测NOX4水平,结果显示NOX4可被c-MYC/miR19b-1-5p调控。7.在H1299,A549细胞系中分别共转染miR-19b-1-5p mimic+NOX4 OE和miR-19b-1-5p inhibitor+si NOX4,利用Western Blot方法检测NOX4,c-MYC,p-AKT和AKT表达水平。结果显示miR-19b-1-5p mimic可抑制NOX4,c-MYC,p-AKT表达,而NOX4可回复该抑制作用,AKT表达水平无明显变化。在A549中,miR-19b-1-5p inhibitor可促进NOX4,c-MYC,p-AKT表达,而NOX4可回复该促进作用,AKT表达水平无明显变化。8.皮下注射肺腺癌A549细胞建立裸鼠异种移植模型,进行瘤内多点注射miR-19b-1-5p agomir,利用micro18F-FDG/PET对动物模型裸鼠进行肿瘤代谢显像,结果发现miR-19b-1-5p agomir抑制肿瘤糖代谢水平,收集小鼠肿瘤组织,发现miR-19b-1-5p agomir抑制裸鼠肿瘤体积和重量,利用免疫组化技术检测糖酵解相关指标,结果提示miR-19b-1-5p agomir抑制裸鼠肿瘤糖酵解关键酶HK2,LDHA,PKM2,PKMR以及NOX4的表达。结论:1.c-MYC通过调控NOX4的表达,影响肺腺癌细胞ROS水平2.c-MYC可结合miR-19b-1-5p发挥转录负调控作用3.c-MYC/miR-19b-1-5p/NOX4形成正反馈环调节糖酵解和ROS影响肺腺癌增殖和迁移