不孕症(infertility)是指凡婚后未避孕、有正常性生活、同居2年而未曾受孕者。受孕是一个极其复杂的生理过程,任何一个环节的障碍都能够导致不孕的发生,其中女性因素约占60%。输卵管因素是最常见因素。造成输卵管不通或功能障碍的原因是急、慢性输卵管炎症。严重的卵管炎症可造成输卵管完全不通,有些炎症虽未造成输卵管管腔堵塞,但内膜被炎症破坏影响内膜细胞的纤毛运动,并且由于瘢痕形成使输卵管壁僵硬,影响输卵管蠕动,从而影响精子和卵子的相遇和运送而致不孕。输卵管炎还可由于输卵管周围器官或组织炎症而继发,尤其是在输卵管伞部或卵巢周围形成炎症粘连,使输卵管伞部不能将排出的卵细胞吸入卵管内,与精子相遇,如化脓性阑尾炎、结核性腹膜炎。在引起不孕不育的众多病原体当中,解脲支原体(ureaplasma urealyticum,uu )感染引起的不孕不育是优生医学界普遍关注的问题之一。支原体是一类原核细胞微生物,体积介于细菌与病毒之间,对支原体分为二十多种亚型,在生殖道常见的有解脲脲原体和人型支原体。人类致病的支原体有3种,其中解脲支原体是人类泌尿生殖道的常见病原体,与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症等都有关系,是普遍认为的性传播疾病的病原体之一。解脲支原体(ureaplasma urealytiam,UU )、人型支原体( mycoplasma hominis,MH )、生殖支原体(mycoplasma genitalium,MG)和沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,CT)都是寄生在泌尿生殖道的微生物。支原体引起女性不孕的主要机理:是造成子宫内膜的慢性炎症,分解粘膜而释放前列腺素,引起子宫收缩,受精卵卵裂,脱落而致不孕。这些感染诱发的变态反应和自身免疫也可能是不育不孕的因素。泌尿生殖道支原体和衣原体感染不但是非淋菌性尿道炎最主要的病因(90%以上),而且已超过淋病,成为发病率最高的性传播疾病(STD)。美国等西方国家已将UU的检查作为不明原因不孕不育症的必查项目。但目前,国际上对UU在女性生殖道的定殖到底可不可以引起不孕还是有一定争议的,因为支原体在正常女性的生殖道中也是存在的,而且国外流行病学调查显示:孕妇80%有支原体的携带,在母婴中的垂直传播率大约为50%,并不是所有的妇女携带有支原体都一定会引起不孕。由于正常人也可以携带支原体,因此虽然大多数学者认为支原体在临床致病性中的地位,但是仍有少数学者认为支原体在致病性中的地位仍有待明确。菌群平衡是宿主常驻微生物群体与宿主生态区在长期进化的过程中形成的,宿主各个器官和系统的正常运作,离不开自身携带的正常微生物群体。盆腔的正常菌群在宿主的体液免疫和细胞免疫过程中有一定的影响,尤其在宿主的生殖过程中,发挥了不可缺少的作用。微生态失调是指正常微生物群之间,以及正常微生物群与宿主之间的微生态平衡,在一些因素的影响下,由生理性组合转变为病理性组合状态。其最重要的影响因素是外环境,当宿主因外力、手术、分娩、性生活等损伤、破坏了微生物防线和解剖组织的屏障结构,或卵巢功能低下,或其他全身性疾病,或大剂量抗生素、抗肿瘤药物免疫抑制剂的使用,极易导致感染性疾病的发生,主要表现为各种难治性的盆腔感染。1、研究目的综合目前国内外的研究,尽管有大量的文献资料支持解脲支原体(ureaplasma urealyticum,uu )是导致不孕不育的病原体之一。但不能否认的是,在相当部分的研究中表明解脲支原体(ureaplasma urealyticum,uu )可以作为一种常驻微生物群体,在宿主体内长期存在。而且在临床的治疗过程中,约70%的UU感染者既往无明显的急性盆腔炎史,约34%的UU感染患者在腹腔镜检查中,并无发现盆腔粘练、输卵管积液等病变的存在。本研究旨在通过腹腔镜这一诊疗手段,获取不孕症女性与正常女性的盆腔积液,分离培养菌群的组成,以探讨解脲支原体(ureaplasma urealyticum,uu )在女性不孕中的定位是致病菌,还是条件致病菌。分析输卵管性不孕患者生殖道微生物的的分布,探讨正常微生态平衡在导致不孕的盆腔炎性疾病中意义,为防治不孕提供诊疗依据。2、研究材料和方法1、研究对象:1.1收集2007年10月~2008年7月在广州医学院第三附属医院妇产科因妇产科疾病接受腹腔镜手术治疗的妇女172例。其中不孕症患者95例,因其他原因(子宫肌瘤、畸胎瘤、卵巢子宫内膜异位囊肿)接受腹腔镜手术治疗的妇女77例。不孕患者中双侧输卵管积液组42例,单侧或无输卵管积液组53例。不孕症患者组最大年龄36岁,最小年龄21岁,不孕年限2～11年。对照组最大年龄40岁,最小年龄22岁。三个组年龄具有可比性(P>0.05)。1.2所有患者在6个月内无盆腹腔其他脏器的急性感染性疾病,如:急性阑尾炎、急性胆囊炎、消化道穿孔等。在6个月内无腹腔穿透性外伤史。所有患者无慢性感染性或免疫性疾病,如:慢性阑尾炎、慢性胆囊炎、慢性结肠炎等,以排除因外界因素对盆腔菌群组成的干扰。1.3不孕症患者按术前1个月的子宫输卵管碘油造影(hysterosalpinography HSG)分为两组。1.3.1双侧输卵管积液组:双侧输卵管不通并有明显串珠样改变、输卵管明显增粗积水、静脉网显影等。1.3.2单侧或无输卵管积液组或:双侧输卵管通畅但有部分炎性表现如部分迂曲、造影剂弥散局限或仅一侧通畅等轻度病变者。2、研究方法:2.1临床资料收集记录患者的姓名、年龄、住院号等,并记录其孕产史、简要病史、体格检查等情况。2.2阴道分泌物的采集使用无菌棉棒,将无菌棉棒围绕阴道上中1/3刮取,置于无菌试管,每例实验对象取材6管。2.3盆腔积液的采集患者在气管内全麻的状态下,采取头高脚低位约10分钟,以使盆腔积液充分积聚,通过腹腔镜的引导,由手术助手以吸引棒拨开肠管,予20毫升注射器吸取盆腔积液,置于肉汤培养管。2.4输卵管积液的采集对一侧或双侧输卵管积液的不孕症病例,在保证不使积液输卵管破溃的前提下,先取盆腔积液送检,然后镜下分离盆腔内个器官间的粘连带,用生理盐水1000ml冲洗盆腔后,将积液卵管远端游离靠近腹壁,经腹壁用硬膜外麻醉所用的穿刺针(长度约为8cm)抽取管内积液,置于肉汤培养管内送检。2.5术中观察子宫及双附件情况,详细记录输卵管形态、粘连情况,并在直视下行输卵管美兰通液术观察输卵管的通畅程度。参照Hager的标准[3]将不孕组患者输卵管外周粘连情况分为轻度以下粘连及中度以上粘连。2.6无菌试管及肉汤培养管立刻送细菌室接种培养,在培养皿(沙氏平板、血平板、巧克力平板、厌氧菌平板、真菌显色培养基、支原体培养基)培养出的菌群全部行细菌鉴定。2.7检测方法2.7.1菌群密集度血液琼脂培养基,用作一般的细菌培养,将培养基放进37℃的温箱中,培养24～48 h;以每毫升标本中的菌落数来表示,通过光镜下观察涂片染色标本中的细菌分布、排列直接判断、分级。2.7.2 UU用培养法将取出标本接种于UU培养基上,37℃环境中培养48 h观察结果。若培养基变红色为阳性,不变色(黄色)为阴性。为提高准确率,同时设立阳性对照和阴性对照。抽样接种固体培养基出现“油煎蛋”样集落。培养衣原体的标本棉签置于2ml MEM培养基中抖动、洗涤棉签上的样本,反复冻融3次,针头滤器过滤后按种于BGM细胞,37℃吸附2h,培养48～72h,然后固定,予Giemsa染色,光学显微镜在细胞内找到包涵体为阳性。抽样30份标本直接免疫荧光鉴定,二者结果相吻。2.7.3菌群多样性通过光镜观察标本中的优势细菌。2.7.4优势菌通过光镜观察与细菌培养方法检测菌群中生物量或种群密集度大的细菌。3、统计学处理采用SSPS11.0统计学软件进行相关的统计分析。比较两组间的差别是否有统计学意义,作LSD检验。P<0.05有统计学意义。3、结果3.1在所有3个妇女组,从阴道分泌物培养出乳酸杆菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、支原体为主的正常阴道微生态,乳酸杆菌的检出率为76.62%,乳酸杆菌为正常妇女的阴道优势菌。3.2支原体在正常妇女阴道检出率为42.86%(33/77)。全部为解脲支原体。各组P>0.05,无显著性差异。3.3正常妇女与不孕妇女阴道的乳酸杆菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、支原体检出率基本相同。3.4不孕妇女组与正常妇女比较,盆腔积液的大肠埃希氏菌、粪肠球菌、支原体检出率较高,P<0.05,有显著性差异。3.5不孕组病例中,腹腔镜见双侧输卵管积液堵塞的患者,盆腔积液的检出菌种较少,<=2种占70%。一侧输卵管积液堵塞或仅有不同程度盆腔粘连的患者,盆腔积液的检出菌种较多,两组间有统计学差异。3.6菌群分布在正常妇女、腹腔镜见双侧输卵管积液堵塞的不孕症妇女、一侧输卵管积液堵塞或仅有不同程度盆腔粘连的不孕症妇女间均有不同。一侧输卵管积液堵塞或仅有不同程度盆腔粘连的不孕症妇女,盆腔积液中大肠埃希氏菌、粪肠球菌、支原体检出率较高,P<0.05,有显著性差异。双侧输卵管积液堵塞的患者,盆腔积液的检出菌种与正常妇女P>0.05,无显著性差异。4、结论1、生殖道菌群的分布有一定的特征,这在女性生殖健康中有重要的意义。2、解脲支原体(ureaplasma urealyticum,uu )在各组的阴道分泌物培养中无显著性差异,提示其可能是女性阴道的正常菌群之一。没有症状的妇女阴道菌群细菌学检查提示支原体阳性,并不意味着支原体有致病性;目前根据阴道菌群细菌学检查的结果,针对支原体而进行的抗生素治疗,不但会促使耐药菌株的出现,而且对女性的生殖道菌群平衡有不利影响,导致盆腔炎症的发生;3、输卵管伞端的闭锁,也是女性下生殖道的防御机制之一,目的在于防止感染的进一步扩散。4、不孕症患者盆腔的菌群组成的变化,提示在一定程度上菌群失调可能参与了不孕患者盆腔病变的机制。5、腹腔镜手术在临床的广泛开展不仅为许多的妇科疾病提供了微创的治疗手段,而且通过器械上的优势,让我们能对不孕症患者的盆腔环境做更进一步的分析和探讨。