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放射性核素尤其是高LETα辐射体内照射在辐射致人类健康的危害中占有极其重要的地位,目前国内外对采用生物指标判断人体是否受到α核素内照射及其内照射生物剂量估算问题,尚未找到有效的解决办法。磷酸化组蛋白2A变异体(yH2AX)是目前公认的DNA双链断裂(DSBs)的分子标志物,可募集参与非同源末端连接(NHEJ)修复的pDNA-PKcs(Thr2609)和参与同源重组(HR)修复的Rad51等修复相关蛋白快速聚集在损伤部位,形成电离辐射诱发的灶(IRIF),己成为监测DSBs及其修复的敏感方法；DSBs修复途径的关键选择因子53BP1亦备受关注,yH2AX口53BP1 IRIF能否成为生物剂量估计指标己成为近年来研究的热点,但其产额随照射后时间的延长快速下降等问题限制了其应用。研究己证实,高传能线密度(LET)射线诱发的DSB-集簇性损伤的复杂性和在异染色质(HC)中的分布是影响DSBs修复速率的重要因素。本研究采用免疫荧光技术,旨在探索高LET旺粒子照射诱发人外周血G0期淋巴细胞yH2AX、53BP1、pDNA-PKcs(Thr2609)和Rad51 IRIF形成与消除动力学的特点,以及它们的空间分布与染色质结构的关系,同时采用TUNEL-FITC法检测α粒子照射诱发人外周血G0期淋巴细胞的凋亡情况,与低LET γ射线照射诱导的DSBs损伤及其修复和凋亡相比较,对于深入了解高LET射线诱导的人外周血Go期淋巴细胞DSB-集簇性损伤的修复特点有着重要意义,并为寻找可能的0[粒子内照射鉴别指标和生物剂量估算指标提供实验依据。本实验还采用免疫荧光技术检测非放射工作人员和放射工作人员外周血淋巴细胞yH2AX、53BP1、 pDNA-PKcs(Thr2609)和Rad51 IRIF表达情况,并与染色体畸变分析相比较,以期初步了解这四类IRIF在人体的表达水平及判断放射工作人员近期是否受到内照射,为探寻评估电离辐射对健康危害的新指标提供依据,为辐射防护与安全提供指导。第一部分：α粒子照射诱发人外周血淋巴细胞DNA双链断裂修复及其在染色质中的分布研究目的探索α粒子照射诱发人外周血淋巴细胞DSBs的修复特点及与染色质结构的关系,为其作为α核素内照射鉴定指标和生物剂量估算指标提供实验依据。方法取4名健康志愿者的外周静脉血,采用淋巴细胞分离液提取抗凝血的淋巴细胞,分为未照射对照组、0.5 Gy α粒子照射组和0.5 Gy γ射线照射组,于照射后10 min-48 h采用免疫荧光技术检测DSBs分子标志物γH2AX、DSBs感应蛋白53BP1、NHEJ修复蛋白pDNA-PKcs(Thr2609)和HR修复蛋白 Rad51 IRIF的形成及其消除动力学,以及它们在染色质中的分布；采用TUNEL-FITC法检测照射后24 h和48h淋巴细胞凋亡率。结果人外周血G0期淋巴细胞经0.5 Gyα粒子照射后10 min～2 h,可见明显的线性γH2AX、53BP1和pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF径迹形成,尤其是γH2AX线性径迹呈现连续和断续线性的形态特征；yH2AX和53BP1 IRIF线性径迹在照后10 min迅速达峰值(P<0.001和P<0.001),pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF线性径迹在照后30 min达峰值(P<0.001),至照后6 h均基本消失,Rad51未见IRIF线性径迹的形成；而0.5 Gyγ射线照射后10min～48 h未见γH2AX、53BP1、 pDNA-PKcs(Thr2609)和Rad51 IRIF线性径迹的形成。IRIF形成和消除动力学及其在染色质中分布的结果显示,γH2AX、53BP1和pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF产额在0.5 Gy α粒子照射后30 min均达到最大值(P<0.001,P<0.01和P<0.001),6 h内均明显下降(P<0.001,P<0.05和P<0.001),至照后24～48 h γH2AX IRIF数仍残留约为16%,而53BP1和pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF已降至本底值；0[粒子照射后10min约27%的γH2AX IRIF位于DAPI亮染的异染色质区,可能与其修复效率明显降低有关,而53BP1和pDNA-PKcs(Thr2609)IRIF均位于DAPI淡染的常染色质区。与之相比较,0.5 Gy γ射线照射后10 min-48 h,随机、散在分布的7H2AX、53BP1和pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF均位于DAPI淡染的常染色质区,IRIF形成数与残留数均显著低于α粒子照射诱发的IRIF数。0.5 Gyα粒子照射后30 min-6 h 7H2AX IRIF形成数显著大于53BP1和pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF形成数,而53BP1 IRIF形成数又显著高于pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF形成数,α粒子照射诱发的此种效应又显著高于γ射线的作用,提示高LET射线比低LET射线诱导产生更多的DSBs小片段干扰DSBs修复,因而作为DSBs分子标志物的γH2AX IRIF显著增加,53BP1募集显著降低,pDNA-PKcs(Thr2609) IRIF仅代表NHEJ修复通路被激活,因此显著低于53BP1 IRIF形成数。HR修复蛋白Rad51 IRIF在α粒子和γ射线照射后30min-2 h有升高趋势,但与本底值无明显差异,且与γH2AX IRIF的共定位仅占3%～8%。0.5 Gyα粒子照射后24～48 h比γ射线照射诱发更高的淋巴细胞凋亡率,表明高LET α粒子较低LETγ射线诱导更为严重的DSBs损伤,更易导致细胞死亡。结论 0[粒子照射诱发人外周血淋巴细胞γH2AX、53BP1和 pDNA-PKcs(Thr2609)线性IRIF径迹形成,尤其是连续和断续的线性γH2AXIRIF径迹的特殊形态可作为判断是否存在α粒子内照射的生物指标；yH2AX残留量在照射后稳定存在一定时间的特性,为其作为生物剂量估算指标提供了可能；NHEJ修复通路在辐射诱导人淋巴细胞DSBs修复中起到重要的作用。第二部分：放射工作人员外周血淋巴细胞DNA双链断裂及其修复蛋白表达水平的检测目的 探索放射工作人员外周血淋巴细胞DNA双链断裂及其修复蛋白IRIF表达及其与染色体畸变的关系,为评价放射工作人员的辐射损伤提供重要依据,为辐射防护与安全提供指导。方法选择7名非放射工作人员和13名放射工作人员,取外周静脉血,采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞后,采用免疫荧光技术检测γH2AX、53BP1、 pDNA-PKcs(Thr2609)和Rad51 IRIF表达,同时进行外周血淋巴细胞的染色体畸变检查。结果 放射工作人员外周血淋巴细胞的γH2AX、53BP1 和 pDNA-PKcs(Thr2609)IRIF形成数与非放射工作人员相比无显著性差异。两组人员的7H2AX IRIF值均很低,在0Φ0.03个/细胞范围内波动,而53BP1 IRIF水平相对较高,在0.04Φ0.31个/细胞范围内波动,亦能检测到pDNA-PKcs(Thr2609)IRIF形成,而Rad5 1 IRIF为0,提示53BP1抗体和pDNA-PKcs(Thr2609)抗体可能存在非特异性的结合。非放射工作人员组、放射工作人员组以及两组合并后,男性与男性、男性与女性以及女性和女性之间7H2AX、53BP1和pDNA-PKcs(Thr2609)IRIF均值亦无明显差异。大于30岁的放射工作人员与小于30岁的非放射工作人员的7H2AX、53BPI和pDNA-PKcs(Thr2609)IRIF形成数均无显著性差异。1例放射工作人员的染色体畸变率为0.5%,在正常范围内,亦未见γH2AX、53BP1、pDNA-PKcs(Thr2609)和Rad51 IRIF形成数的变化。结论 放射工作人员与非放射工作人员之间外周血淋巴细胞γH2AX、53BP1、pDNA-PKcs(Thr2609)和Rad51 IRIF形成数均无显著性差异,且与染色体畸变、年龄和性别无明显相关性,尤其是yH2AX IRIF本底值很低,为其作为放射损伤的评价指标提供了可能,尚有待增加样本量以进一步验证。