第一部分香烟提取物抑制人气道平滑肌细胞CEBPα表达而促进了细胞增殖一、研究背景慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种发病率和死亡率较高的疾病,造成了严重的社会、经济负担。香烟烟雾和其他有害颗粒的吸入是COPD的重要危险因素之一,它启动了一系列的气道、肺组织慢性炎症反应,继而出现气道肺组织破坏与修复,疾病进展与气道重塑相关,是COPD气流受限逐渐进展的主要病理基础,最终影响肺功能。COPD中的气道重塑是以粘液细胞的增生肥大、细支气管周纤维化及气道平滑肌细胞(ASMCs)的增殖为特点,在气道重塑中气道平滑肌的增殖是其中重要环节之一。研究发现在吸烟的COPD患者以及熏香烟复制的大鼠COPD模型中,ASMCs都显著增生。另一方面,ASMCs除了其收缩的机械特性外,可表达、释放多种致细胞因子、淋巴因子及促生长因子(如IL-6、IL-8及TGF-β等),同时在炎症介质的作用下,促进中性粒细胞细胞、巨噬细胞向气道、肺组织局部粘附,从而加重COPD的气道炎症,进一步促进气道重塑。故而ASMCs的增殖成为了研究COPD的气道重塑热点之一。转录因子CCAAT增强子结合蛋白家族(CEBPs)包括CEBPα、β、δ、γ、ε和ζ六个蛋白,属于bZIP蛋白家族,是一组转录调控因子,它们具有多种功能,在细胞增殖、分化、信号传导、肿瘤发生以及机体的炎症反应、能量代谢、血液生成等方面发挥重要作用,与许多疾病的发生和发展密切相关。其中转录因子CCAAT增强子结合蛋白α (CEBPα)是一种具有抑制细胞增殖活性的转录因子,广泛表达于肺组织、肝脏及骨髓干细胞等。CEBPα已被证明在脂肪细胞分化、肝脏和脂肪细胞类型的调节,以及能量代谢和细胞增殖方面发挥着重要作用。体外实验研究发现CEBPα能抑制肝细胞的增殖,研究发现CEBPα基因敲除小鼠在生长发育过程中表现出肺组织发育不成熟,而且小鼠肺上皮细胞CEBPα基因敲除后出现肺上皮细胞、肺泡细胞的增殖及分化受抑制。小鼠成年后的肺组织则表现出类似COPD的组织学表现及炎症特征,说明CEBPα在COPD发病机制的中起重要作用。在哮喘患者的ASMCs研究中发现,CEBPα的表达是明显下降,且在体外以室内尘螨提取物作用于哮喘患者的ASMCs后CEBPα的表达下降,但使其细胞增殖呈明显增加,说明室内尘螨提取物刺激哮喘患者的ASMCs细胞增殖加速是与CEBPα的表达下降相关的,CEBPα在其中扮演着抗增殖作用。香烟烟雾是COPD重要危险因素之一,体外实验研究发现在一定浓度CSE作用下可促进ASMCs增殖,那么其中具体机制如何?此时抑制细胞增殖的转录因子CEBPα的表达及发挥的作用如何?我们在本研究中以不同浓度CSE刺激下体外培养人ASMCs,了解ASMCs的增殖情况以及相应的CEBPα的表达,探讨CEBPα在CSE促进了ASMCs的增殖中的作用。二、方法(一)、制备不同浓度的香烟提取物。(二)、采用siRNA技术转染相应的阴性对照siRNA、CEBPαsiRNA。(三)、分组。1、按照不同CSE的浓度分组：2.5% CSE组、5% CSE组、10%CSE组、15%CSE组、20% CSE组、对照组,比较各组间人ASMCs的增殖程度及CEBPα表达。2、在10%CSE浓度条件下,进一步通过分别对人ASMCs转染CEBPαsiRNA、阴性对照siRNA相应分为CEBPαsiRNA组、阴性对照siRNA组。比较两组ASMCs的CEBPα表达及增殖程度的差异。(四)、MTT比色法分析人ASMCs的增殖程度(吸光度值DD490nm表示)。(五)、采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。(六)、采用免疫印迹法(Western blot法)检测人ASMCs中CEBPα的表达。(七)、统计学方法：使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。所有计量资料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析,方差齐性时多重比较采用LSD法,方差不齐采用DuunettT3法。两独立样本计量资料比较t检验。P<0.05为有统计学意义。三、结果(一)、不同CSE浓度作用下人ASMCs的增殖程度：2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、15%CSE组、20% CSE组、对照组人ASMCs的细胞增殖程度(OD490nm)分别为：0.270±0.034、0.321±0.041、0.368±0.043、0.293±0.033、0.259±0.034、0.187±0.024(F=18.43,P<0.001)。在2.5～10%CSE作用下,随着CSE浓度的增高人ASMCs的增殖程度逐渐增加,在10%CSE作用下达到峰值,之后20%CSE浓度作用下细胞增殖程度出现下降趋势。推测高于10%的CSE可能存在直接细胞毒性作用,抑制了细胞增殖,故选取2.5-10%CSE作为后续试验刺激浓度。(二)、不同CSE浓度下人ASMCs的CEBPα的表达。2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、对照组ASMCs的CEBPα蛋白表达分别为：0.622±0.084、0.497±0.098、0.368±0.077、0.733±0.101(F=18.238,P<0.001),提示各组间有统计学差异。而相应地各组CEBPαmRNA表达分别为：0.696±0.126、0.713±0.125、0.677±0.142、0.661±0.133(F=0.174,P=0.912),提示各组间无统计学差异。提示随着CSE浓度的递增,CEBPα蛋白表达逐渐减少,但CEBPαmRNA表达无差异。(三)、在10% CSE作用下,CEBPαsiRNA组、阴性对照siRNA组人ASMCs中CEBPα表达及细胞增殖程度的比较。CEBPαsiRNA组、阴性对照siRNA组中人ASMCs的CEBPα蛋白表达分别为0.232±0.084、0.378±0.119(t=2.460,P=0.034),前者显著低于后者；而细胞增殖程度分别为0.570±0.100、0.353±0.104(t=3.666,P=0.004),前者显著高于后者,均有统计学差异。提示采用siRNA技术抑制人ASMCs中CEBPα的表达后,细胞增殖程度反而增加。四、结论本研究发现,在香烟提取物作用下,气道平滑肌细胞下CEBPα蛋白表达受抑制,相应的促进了细胞增殖。而这种CEBPα的蛋白的表达受抑制主要是受转录后调控的。在采用siRNA技术抑制CEBPα的蛋白表达后,人ASMCs的增殖反而增加,说明CEBPα在气道平滑肌中扮演着抗细胞增殖作用。第二部分 香烟提取物对人气道平滑肌细胞增殖中钙网织蛋白及CEBPa表达的影响一、研究背景气道重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的一个重要特征,是COPD逐渐进展的气流受限的基础。气道平滑肌层的增加是气道重塑中的特点之一,甚至有研究发现气道平滑肌层厚度与在重度至极重度COPD的气流受限是相关。经典的COPD动物模型多由香烟烟雾的熏制、气道注入内毒素而成,显示气道壁以淋巴细胞为主的炎细胞浸润明显,上皮细胞、杯状细胞、粘液腺体及平滑肌显著增生,管壁胶原纤维显著增多,肺气肿形成。研究中发现,香烟提取物可促进体外ASMCs的增殖。在第一部分的实验中,我们发现一定浓度香烟提取物作用下人气道平滑肌细胞的CEBPα表达受抑制而促进了细胞的增殖,而这种CEBPα的蛋白的表达受抑制主要是受转录后调控的。那么,此时CEBPα表达的转录后调控机制如何?研究资料已发现CEBPα是一种具有抑制细胞增殖活性的转录因子,它广泛表达于肺组织、肝脏及骨髓干细胞等,CEBPα与慢性气道炎症性疾病如COPD、哮喘有着密切关系。CEBPαmRNA包含有3个翻译起始位点(AUG),因此,人类CEBPαmRNA分别被翻译成为三个大小不同的蛋白42KD、40KD和30KD,仅全长P42CEBPα有着以上的生物学功能。钙网织蛋白是在CEBPαmRNA的转录后调控过程中的重要调控因子之一,其机制是由于钙网织蛋白与CEBPαmRNA的茎环结构结合形成了GC富集模体,而这种复合物抑制CEBPαmRNA翻译为全长42KD的CEBPα,从而抑制了其生物学活性。在脂肪细胞的研究中发现CEBPα与钙网织蛋白的表达是呈负相关,且近期在哮喘患者的研究中发现其ASMCs中CEBPα的低表达是受钙网织蛋白调控的。那么在不同浓度CSE作用下,ASMCs中钙网织蛋白表达如何?香烟提取物促进气道平滑肌细胞增殖是否与CEBPα的转录后调控的重要因子——钙网织蛋白有关?我们在本研究中以不同浓度香烟提取物刺激下体外培养人气道平滑肌细胞,了解抑制细胞增殖的重要因子CEBPα和其上游调控因子——钙网织蛋白的表达,探讨CEBPα上游调节因子钙网织蛋白在香烟提取物促进气道平滑肌细胞增殖中发挥的作用。二、方法(一)、制备不同浓度的香烟提取物。(二)、采用siRNA技术转染相应的钙网织蛋白siRNA及阴性对照siRNA至人气道平滑肌细胞。(三)、分组1、按照不同CSE的浓度分组：2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、15%CSE组、20%CSE组、对照组,比较各组间ASMCs的增殖程度及CEBPα表达。2、在10%CSE浓度条件下,进一步通过分别对ASMCs转染钙网织蛋白siRNA及阴性对照siRNA相应分为钙网织蛋白siRNA组及阴性对照siRNA组。比较两组ASMCs的CEBPα、钙网织蛋白的表达及细胞增殖程度的差异。(四)、以MTT比色法分析各组人ASMCs的增殖程度(吸光度值OD490nm表示)。(五)、采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。(六)、采用免疫印迹法(Western blot法)检测各组人ASMCs中CEBPα、钙网织蛋白的表达。(七)、统计学方法：使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。所有计量资料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析,方差齐性时多重比较采用LSD法,方差不齐采用DuunettT3法。两独立样本计量资料比较t检验。P<0.05为有统计学意义。三、结果(一)、不同CSE浓度作用下人ASMCs的增殖程度：2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、15%CSE组、20% CSE组、对照组ASMCs的细胞增殖程度(OD490nm)分别为：0.270±0.034、0.321±0.041、0.368±0.043、0.293±0.033、0.259±0.034、0.187±0.024(F=18.43,P<0.001)。在2.5～10%CSE作用下,随着CSE浓度的增高ASMCs的增殖程度逐渐增加,在10%CSE作用下达到峰值,之后15%CSE、20%CSE浓度条件下则细胞增殖程度出现下降趋势。说明高于10%的CSE可能存在直接细胞毒性作用,抑制了细胞增殖,故选取2.5～10%CSE作为后续试验刺激浓度。(二)、不同CSE浓度下人ASMCs的CEBPα的表达。2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、对照组ASMCs的CEBPα蛋白表达分别为：0.622±0.084、0.497±0.098、0.368±0.077、0.733±0.101(F=18.238,P<0.001),提示各组间有统计学差异。而相应地CEBPamRNA表达分别为：0.696±0.126、0.713±0.125、0.677±0.142、0.661±0.133(F=0.174,P=0.912),提示各组间无统计学差异。提示随着CSE浓度的递增,CEBPα蛋白表达逐渐减弱,但CEBPamRNA表达无差异。(三)、不同CSE浓度下人ASMCs中钙网织蛋白表达。2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、对照组ASMCs中钙网织蛋白表达分别为：0.489±0.088、0.620±0.103、0.771±0.087、0.293±0.092(F=28.628,P<0.001),各组间有统计学差异。提示随着CSE浓度的递增,钙网织蛋白的表达逐渐增加。(四)、在10% CSE作用下,钙网织蛋白siRNA组、阴性对照siRNA组人ASMCs中钙网织蛋白、CEBPa表达、细胞增殖程度的比较。钙网织蛋白siRNA组、阴性对照siRNA组中人ASMC的钙网织蛋白的表达分别为0.544±0.132、0.754±0.126(t=2.826,P=0.018),前者显著低于后者；CEBPα蛋白表达分别为0.547±0.063、0.380±0.180(t=3.285,P=0.008),前者显著高于后者；而细胞增殖程度分别为0.262±0.065、0.390±0.079(t=3.082,P=0.012),前者显著低于后者,均有统计学差异。提示在10%CSE条件下,钙网织蛋白siRNA组较阴性对照siRNA组中钙网织蛋白表达减弱,但CEBα表达增强,而相应地细胞增殖程度减弱。四、结论本研究发现,一定浓度CSE作用下,人气道平滑肌细胞中钙网织蛋白的表达随着CSE浓度增加而增强,而CEBPα的蛋白表达随着CSE浓度增加而减弱。采用siRNA技术抑制钙网织蛋白表达后,反而CEBPα蛋白表达增强,继而气道平滑肌细胞增殖减弱。说明在一定浓度CSE作用下ASMCs中CEBPα的蛋白表达受抑制是受钙网织蛋白调控的,进而影响了ASMCs的增殖。第三部分香烟提取物通过CEBPα调控细胞周期促进了人气道平滑肌细胞增殖一、研究背景CCAAT增强子结合蛋白(CEBP)家族包括CEBPα、β、δ、γ、ε和ζ六个蛋白,属于bZIP蛋白家族,其中CCAAT增强子结合蛋白α (CEBPα)是一种具有抑制细胞增殖活性的转录因子,它广泛表达于肺组织、肝脏及骨髓干细胞等。研究发现CEBPα通过直接抑制细胞周期的限速酶——细胞周期蛋白激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白激酶4(CDK4)以及诱导细胞周期抑制剂p21Wafl/Cipl的表达等多方面机制进而阻滞了细胞周期,最终抑制了细胞增殖。细胞周期是细胞生命活动的基本过程,细胞周期在不同时相的多个调控点上受到调节,其中主要有三个调控点即Gl/S、G2/M和有丝分裂中期/后期,而G1/S的调控点是细胞内外信号经过传递、整合汇集到细胞核,对细胞的增殖进行调控的关键点,通过此点后,细胞的分裂、增殖基本上是由细胞内部自主完成的过程。研究发现在CEBPa基因敲除的肝细胞中,CDK2、CKD4的表达增强,肝细胞增殖加速,CEBPα是通过直接及间接作用于CDK2、CKD4而发挥了生物学效应。在以上两部分的研究中,我们发现一定浓度香烟提取物(CSE)抑制了人气道平滑肌细胞(ASMCs)中CEBPα表达进而促进了细胞增殖,那么CEBPα是如何发挥其抗细胞增殖的效应呢?此时与其密切相关的CDK2、CKD4的表达如何?受抑制的CEBPα是否通过影响CDK2、CKD4的表达而干预细胞周期最终促进细胞增殖呢?我们在本研究中以不同浓度香烟提取物作用于体外培养人ASMCs,了解人ASMCs中抑制细胞增殖的重要因子CEBPα以及细胞周期重要限速酶CDK2、CDK4的表达变化,并分析细胞周期各期比例变化,另外,采用siRNA技术抑制CEBPα的表达后CDK2、CDK4的表达及细胞周期各期比例的变化,从而探讨在香烟提取物作用下CEBPa是否通过调控细胞周期的分布而发挥其抑制细胞增殖的作用。二、方法(一)、制备不同浓度的香烟提取物。(二)、采用siRNA技术转染相应的CEBPasiRNA、阴性对照siRNA。(三)、分组1、按照不同CSE的浓度分组：2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、15%CSE组、20%CSE组及对照组,比较各组间人ASMCs的增殖程度及CEBPa表达。2、在10%CSE浓度条件下,进一步通过分别对人ASMCs转染CEBPαsiRNA、阴性对照siRNA相应分为CEBPasiRNA组、阴性对照siRNA组。比较两组人ASMCs的CEBPα表达、细胞周期分布及增殖程度的差异。(四)、以MTT比色法分析人ASMCs的增殖程度(吸光度值OD490nm表示)。(五)、采用免疫印迹法(Western blot法)检测人ASMCs中CEBPα、CDK2及CDK4的表达。(六)、流式细胞仪进行细胞周期测定,计算各组人ASMCs中G0/G1期细胞比例、S期、G2/M期细胞比例。(七)、使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。所有计量资料以x±s表示。多组间均数比较采用单因素方差分析,方差齐性时多重比较采用LSD法,方差不齐采用DuunettT3法。两独立样本均数计量资料比较t检验。P<0.05为有统计学意义。三、结果(一)、不同CSE浓度下人ASMCs的增殖程度2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、15%CSE组、20%CSE组、对照组ASMC的细胞增殖程度(OD490nm表示)分别为：0.270±0.0330.321±0.041、0.368±0.043、0.293±0.033、0.259±0.034、0.187±0.024(F=18.43,P<0.001)。即随CSE浓度的增高人ASMCs的增殖程度起初逐渐增加,在10%CSE作用下达到峰值,之后15%CSE、20%CSE浓度组则出现下降趋势。推测高于10%的CSE可能存在直接细胞毒性作用,故选取2.5～10%CSE作为后续试验刺激浓度。(二)、2.5～10%CSE浓度下人ASMCs的CEBPα的表达2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组及对照组人ASMC相应的CEBPα蛋白表达分别为：0.622±0.084、0.497±0.098、0.368±0.077、0.733±0.101(F=18.238,P<0.001),各组间有统计学差异。提示随着CSE浓度的递增,CEBPα蛋白表达逐渐减弱。(三)、2.5～10%CSE浓度下人ASMCs的CDK2、CDK4的表达2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组、对照组中ASMC的CDK2表达分别为：0.288±0.060、0.460±0.043、0.689±0.083、0.198±0.035(F=82.746,P<0.001),CDK4表达分别为：0.322±0.037、0.579±0.090、0.726±0.066、0.208±0.036(F=88.408,P<0.001),各组间均有统计学差异。提示随着CSE浓度的递增,CDK2、CDK4的表达均逐渐增加。(四)、2.5～10%CSE浓度下人ASMCs中G0/G1、S期、G2/M期细胞比例(%)的比较。2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组及对照组中ASMC的G0/G1期细胞比例(%)分别为：72.1±2.8、62.3±3.8、54.0±6.0、77.8±4.3(F=34.616,<0.001),各组间有统计学差异；S期细胞比例(%)分别为：23.8±2.9、33.9±4.1、40.8±2.6、17.5±3.0(F=61.419,<0.001),各组间有统计学差异；G2/M期细胞比例(%)分别为：4.1±1.7、3.9±2.5、5.2±3.6、4.7±1.6(F=0.357,P=0.785),各组间无统计学差异。提示随着CSE浓度的递增,G0/G1期细胞比例递减,S期细胞比例递增,G2/M期细胞无显著变化。(五)、在10%CSE作用下,CEBPαsiRNA组、阴性对照siRNA组中CEBPα表达、细胞增殖程度及细胞周期分布的比较。CEBPαsiRNA组、阴性对照siRNA组中ASMCs的CEBPα蛋白表达分别为0.232±0.084、0.378±0.119(t=2.460,P=0.034),前者显著低于后者；而细胞增殖程度分别为0.562±0.050、0.353±0.038(t=8.144,P<0.001),前者显著高于后者,CDK2的表达分别为0.778±0.045、0.654±0.085(t=3.148,P=0.010),前者显著高于后者；CDK4的表达分别为0.792±0.062、0.709±0.044(t=2.653,P=0.024),前者显著高于后者；G0/G1期细胞比例(%)分别为44.9±1.8、57.7±4.6(t=6.277,<0.001),前者显著低于后者；S期细胞比例(%)分别为43.7±4.1、34.7±6.3(t=2.916,P=0.015),前者显著高于后者；G2/M期细胞比例(%)分别为13.4±3.0、8.3±2.5(t=3.225,P=0.009),前者显著高于后者,均有统计学差异。提示在10%CSE作用下,CEBPasiRNA组较阴性对照siRNA组ASMCs中CEBPα表达减弱,而CDK2、CDK4表达增强,进而细胞周期中G0/G1期细胞比例显著减少,同时S期、G2/M期细胞比例显著增多,最终加速细胞增殖。四、结论本研究发现,一定浓度CSE作用下ASMCs中CEBPα的表达受抑制,进而促进了其下游细胞周期关键调节者CDK2、CDK4活性表达,从而使G0/G1期细胞比例减少、细胞周期中S期和G2/M期细胞比例显著升高,这表明细胞由G1期向S期转化加速,最终促进了ASMCs的增殖。总结以上一系列研究发现,一定浓度CSE作用下人气道平滑肌细胞的增殖加速,其中的机制考虑与人气道平滑肌细胞中钙网织蛋白的表达增强有关,进而通过转录后调控机制抑制了CEBP/α mRNA的翻译,导致CEBP/α的蛋白表达受抑制,继而促进了其下游的细胞周期调节者CDK2、CDK4活性表达,使S期、G2/M细胞比例显著升高,这表明细胞由G1向S期的转化加速,最终促进了气道平滑肌细胞的增殖。