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原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是中国最常见的恶性肿瘤之一,其预后极差,发病机制尚不明确,对肝癌发生的分子机制研究一直为学者们探索的热点问题。人宫颈癌基因(Human cervical cancer oncogene,HCCR)在正常人血清中不能被检测,在肝细胞癌和肝硬化患者血清中可以被检测,而且其对肝癌尤其是早期肝癌诊断的特异性和敏感性均高于AFP。这提示HCCR癌基因可能在肝细胞癌的病变早期就开始起作用,促进肝细胞癌的发生和发展。本研究的主要内容为HCCR分子在肝细胞癌发生中的作用及其机制研究。
目的：
研究HCCR分子表达在肝细胞癌变中的作用,并研究其发挥作用的分子机制。
方法：
1.1.ICCR与肝细胞癌发生相关性的研究:构建HCCR启动子区报告基因表达载体,应用双荧光素酶报告基因检测的方法比较不同恶性程度的肝(癌)细胞系QSG7701细胞、Huh7细胞和HepG2细胞中HCCR启动子的相对活性;
应用Western blot方法分别检测人和小鼠从正常到肝癌发展不同阶段肝组织中的HCCR蛋白的表达水平差异;
2.HCCR在肝细胞癌发生中的作用研究:构建稳定转染HCCR的HepG2细胞系和QSG7701细胞系,显微镜下观察稳定转染HCCR后HepG2细胞的形态学改变:MTT方法检测稳定转染HCCR的HepG2细胞系和QSG7701细胞系的细胞增殖能力的改变。
3.HCCR表达对肝癌影响的分子机制研究:分析HCCR对E-钙粘素(CDH1;E-Cadherin)的影响和分子机制。构建CDH1启动子的报告基因载体,并通过分别在人胚肾细胞293A和肝细胞QSG7701中过表达HCCR检测其启动子活性的改变,以确定HCCR是否影响CDH1分子的启动子活性.通过构建重组表达HCCR的腺病毒载体来过表达HCCR,并用重组腺病毒感染293A细胞和QSG7701细胞,通过实时定量PCR方法研究HCCR对CDH1 mRNA的影响。
结果：
1.HCCR随肝癌的发生发展表达逐渐增加:HCCR启动子的相对活性在恶性程度较低的QSG7701细胞系中较低,而在恶性程度较高的Huh7细胞和HepG2细胞中较高;HCCR在人和小鼠肝组织中的蛋白表达水平均随肝癌的发展而表达逐渐增加。
2.HCCR影响肝细胞的形态,促进肝细胞的增殖:稳定转染HCCR后,HepG2细胞形态由圆形变成梭形,且细胞聚集程度下降;稳定转染HCCR后的HepG2细胞和QSG7701细胞的细胞增殖能力均有显著的提高。
3.HCCR表达引起细胞分子表达的改变:基因表达谱芯片结果显示:HCCR过表达的HepG2细胞中CDH1分子的表达降低;感染HCCR重组腺病毒后,实时定量PCR方法检测结果显示HCCR可以降低293A细胞和QSG7701细胞的CDH1分子的mRNA水平,且在上述两种细胞中HCCR均能降低CDH1分子的启动子活性。
结论：
1.HCCR启动子相对活性在肝癌细胞系较正常肝细胞系高。HCCR蛋白在人和小鼠肝组织中的表达随肝细胞癌的进展逐渐增加。HCCR随肝癌的发生发展转录活性和蛋白表达逐渐增加。
2.HCCR表达可以明显提高肝细胞的增殖能力,可以促进肝癌细胞形态改变,可能参与肝细胞的转分化。
3.HCCR可以在293A细胞和QSG7701细胞中抑制CDH1分子的启动子活性。
4.成功构建了重组表达HCCR的腺病毒载体,并通过其感染293A细胞和QSG7701细胞验证了HCCR可以在mRNA水平上负调控CDH1分子的表达。