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本文筛选和分析了青石斑鱼(Epinephelus awoara)基因组DNA中的微卫星序列,并根据微卫星序列设计微卫星引物研究了青石斑鱼、蜂巢石斑鱼(E. merra)、鲑点石斑鱼(E.fario)、黑边石斑鱼(E.fasciatus)、鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)、赤点石斑鱼(E. akaara)、七带石斑鱼(E. septemfasciatus)、斜带石斑鱼(E.coioides)和棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)9种中国南海海域石斑鱼的遗传多样性和系统发生关系。
以中国南海海域青石斑鱼为材料,采用常规法从血液中提取DNA,经限制性内切酶Dra Ⅰ和Hae Ⅲ部分酶切并将A碱基加在酶切产物末端后,将片段连接到pUCm-T载体上,转入大肠杆菌DH5a构建小片段部分基因组DNA文库。以M<,13>通用引物和自行设计合成的重复序列(CA)<,15>为引物,用PCR法对文库进行筛选。对其中28个重组阳性克隆子进行测序后共获得96个微卫星序列,其中完美型(perfect)40个(占41.7%),非完美型(imperfect)29个(占30.2%),混合完美型(compound perfect)7个(占7.3%),混合非完美型(compoundimperfect)20个(占20.8%)。实验结果同时表明在青石斑鱼的基因组DNA中含有多种不同碱基组成的重复序列,二碱基的微卫星比例最大,(CA/GT)n的含量最为丰富(58%),重复次数大多集中在5~30次(占75%)。将微卫星序列提交至GenBank,审核后获得登陆号(DQ914892~DQ914916)。
用Primer5.0软件根据微卫星侧翼序列设计27对引物,分析9种石斑鱼的遗传多样性与系统发生的关系。经PCR扩增显示有13对引物能同时在这9种石斑鱼中得到清晰稳定的谱带,用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测产物,硝酸银染色后,用GENPOP 3.4软件对扩增结果进行了统计分析。13个位点在9种石斑鱼中共检测到84个等位基因。9种石斑鱼的平均观测杂合度(Ho)为0.5241(0.4229~0.6373),平均期望杂合度(He)为0.4245(0.3515~0.4845),平均多态信息含量(PIC)为0.3561(0.2663~0.4228),平均Hardy-Weinberg遗传偏离指数(D)为0.1924(0.1123~0.2828)。以上遗传参数表明9种石斑鱼的遗传多样性都处于中等偏下水平(赤点石斑鱼的遗传多样性最低)。
由DISPAN软件计算得到9种石斑鱼问的奈氏遗传距离(D<,A>)和奈氏标准遗传距离(Ds)表明,Ds普遍比D<,A>大,斜带石斑鱼和棕点石斑鱼有着最小的遗传距离(D<,A>=0.1557,Ds=0.2613),青石斑鱼与其他石斑鱼的距离都比较近,而七带石斑鱼与其他石斑鱼的距离都较远。以D<,A>和Ds两种遗传距离为参数采用NJ法构建系统发生树,得出的聚类图都一致将9种石斑鱼分为3个支系:斜带石斑鱼、棕点石斑鱼和鞍带石斑鱼为第1支;青石斑鱼、赤点石斑鱼和七带石斑鱼为第2支系:蜂巢石斑鱼、黑边石斑鱼和鲑点石斑鱼为第3支系。其中第2支系与第3支系的关系较近,第1支系与第3支系关系较远。在本研究所得的聚类图中鞍带石斑鱼(宽额鲈)与斜带石斑鱼和棕点石斑鱼有较近的亲缘关系而一起聚在石斑鱼属内部,并没有表现出属的差异,因此,本研究支持将宽额鲈(鞍带石斑鱼)归入石斑鱼属。