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蓖麻毒素（Ricin Toxin,RT）、相思子毒素（Abrin Toxin,AT）、A型肉毒毒素（Botulinum neurotoxin type A,Bo NT/A）、产气荚膜梭菌α毒素（Clostridium perfringens alpha toxin,CPA）、产气荚膜梭菌ε毒素（Clostridium perfringens epsilon toxin,ETX）、真菌T-2毒素（T-2 toxin）和黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）七种生物毒素均具有毒性强、来源广和易制备等特点,是潜在的生物战剂和生物恐怖剂,具有很强的社会危害性,也能够造成重大的军事威胁。为应对这些重要生物毒素的威胁,有效处置生物毒素引起的生物恐怖事件、生物战现场或公共卫生中毒事件,迫切需要快速、准确、灵敏、特异的现场检测方法。目前应用最为广泛的生物毒素现场快检方法是胶体金免疫层析方法（colloidal gold-immunochromatographic assay）,其耗时短、操作简单、成本低廉,但灵敏度低且无法实现定量检测。本研究建立的时间分辨荧光免疫层析方法（time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA）弥补了上述方法的缺点,该方法将时间分辨荧光与免疫层析技术相结合,利用镧系元素Stokes位移大、荧光寿命长等荧光特性,建立了灵敏度高、特异性强、线性范围广、可定量的生物毒素现场检测方法,在生物安全领域具有重要的潜在应用价值。为了提高生物毒素检测方法的准确性,利用本研究制备或选定相应的生物毒素作为参考品（reference material,RM）开展了各种生物毒素的定量检测工作,它不仅可以为检测方法的定量结果提供较为准确的度量标准,也可作为毒素检测方法的重要评价工具,可有效提高和推进毒素相关检测产品的研发进程。本研究的目的包含两个方面,一是制备、鉴定7种重要生物毒素参考品;二是制备一种镧系高敏荧光聚苯乙烯纳米微球,并以此为基础建立针对多种生物毒素的现场定量检测方法。首先是7种重要生物毒素参考品的研制。本研究采用亲和层析、凝胶过滤和离子交换等方法制备并获得了RT、AT、Bo NT/A与ETX四种天然毒素与一种CPA重组蛋白毒素共五种大分子毒素。针对这类大分子毒素,均采用蛋白分析方法对其特异性、纯度、含量及活性进行测定;例如,SDS-PAGE与HPLC测定其纯度,体外细胞毒性试验或小鼠生物学试验确定其活性,紫外法确定其含量。亲和层析纯化获得天然RT和AT,分子量约为64 k Da、63 k Da,含量为0.228 mg/m L、0.317 mg/m L,纯度为90.59%、95.96%,实时细胞活性检测（Real-time cell analysis,RTCA）结果IC50为2.79 ng/m L、5.41 ng/m L;离子交换法获得天然Bo NT/A、ETX,分子量约为150 k Da、33 k Da,含量为0.153mg/m L、0.359 mg/m L,其中Bo NT/A为复合物使用SDS-PAGE纯度指标代替,其纯度＞90%,小鼠毒力试验LD50为1.41 ng/m L,ETX纯度为96.42%,IC50为9.9μg/m L;重组表达纯化获得的CPA,其分子量约为43 k Da,含量为0.182mg/m L,纯度为95.87%,IC50为4.49 ng/m L。另外2种小分子毒素（T-2毒素与AFB1）商品化较为成熟,我们购买了3个品牌的两类毒素进行对比分析。针对这类毒素,主要采用小分子化合物常用的分析方法对其特异性、纯度与含量进行分析,例如,通过检测碳氢谱对其结构及特异性进行鉴定,LC-MS/MS方法进行定量。AFB1和T-2毒素的分子量为466.51 Da、312.27 Da,含量为99.6μg/g、100.6μg/g,均无明显杂质,核磁碳氢谱显示其结构正确,均与理论值相一致。然后,本研究采用种子乳液聚合法制备了均一性及分散性良好的镧系高敏荧光聚苯乙烯纳米微球,表征结果显示其平均粒径分别为100、185、310 nm,呈圆球形,激发光谱约412 nm,实现了可见光激发。以此为基础,根据生物毒素化学结构的不同,大分子毒素与小分子化合物毒素的试纸条分别采用了双抗夹心法、竞争法的原理进行实验设计,最终成功研制了针对上述7种生物毒素的镧系高敏荧光免疫层析试纸条检测卡,该检测卡操作简单、灵敏度高、特异性良好。其中,RT、Bo NT/A、ETX、AFB1检测卡的最低检测限均为0.5ng/m L,定量范围为0.5～50 ng/m L;T-2毒素的LOD为10 ng/m L,定量范围为10～250 ng/m L;5种毒素试纸条的变异系数均小于15%。橙汁、牛奶、污水、血清4种模拟样本的检测效果良好。CPA与AT试纸条的最低检测限分别为1000 ng/m L、500 ng/m L,特异性良好,待下一步优化后提高灵敏度。最终,研制的镧系高敏荧光免疫层析检测卡与配套的小型便携化检测仪器配套使用,具有检测快速、定量准确、结果可远程传输的优势。综上所述,本文研制获得了7种重要生物毒素参考品,经鉴定均具有良好的特异性、纯度、活性等特性量值,可作为毒素检测试剂的参考品,为生物毒素检测方法的评价提供了重要的度量工具;并成功制备了性能优越的镧系荧光微球,利用其建立了基于镧系高敏荧光的生物毒素现场定量检测方法,该方法灵敏度高、定量线性范围广、特异性良好,在生物毒素定量检测领域具有很高的应用价值。