随着人口老龄化进程发展，老年人脑白质损伤（WML）发病率日益增多，可造成老年人的认知功能障碍，严重影响其生活质量及健康。慢性脑灌注不足被认为是造成WML的最主要因素，但其致病机制及治疗手段均不明确。既往研究表明，WML的主要病理改变是脑内少突胶质细胞（OLs）的死亡丢失、髓鞘的脱失以及轴突的变性坏死。因此，补充死亡丢失的OLs、修复受损髓鞘，从而改善认知功能障碍成为目前防治WML的重要策略。OLs是中枢神经系统的成髓鞘细胞，其来源于脑白质原位的少突胶质前体细胞（OPC）以及室管膜下区（SVZ）的多潜能神经干细胞。在脑白质脱髓鞘损伤后的修复过程中，损伤原位的OPC可通过增殖分化补充死亡丢失的OLs。因此，寻找促进OPC增殖分化，补充死亡丢失OLs的方法是治疗WML的关键所在。在前期研究中，本课题组已发现，阿司匹林（ASA）可以促进OPC的增殖、分化及成熟，从而修复受损髓鞘，改善大鼠认知功能。可能的机制涉及ASA通过抑制OPC及OLs上EphA4受体，影响下游ERK及RhoA活性，从而发挥促进OPC增殖、分化及成熟的作用。本实验将重点研究EphA4受体在OPC及OLs中的表达定位情况及阿司匹林对其的影响，并通过特异性抑制剂阻滞EphA4受体活性，在体研究对WML模型大鼠损伤原位OPC增殖、分化及髓鞘形成的影响；离体研究对培养OPC增殖、分化的影响；最后检测下游信号ERK/p-ERK、RhoA的活性变化，为ASA治疗WML提供实验依据，并为治疗WML的药物研发提供新的作用靶点。　　实验一：EphA4受体在少突胶质细胞系表达情况及阿司匹林对其的影响　　目的：研究EphA4受体在大鼠胼胝体部及体外培养OPC、OLs中表达及细胞定位情况，并观察ASA对其的影响；　　方法：1）获取正常大鼠脑组织标本，通过免疫荧光双标记化学染色法观察大鼠胼胝体部NG2/EphA4、CNPase/EphA4共表达情况；2）原代培养获取大鼠OPC及OLs，通过免疫荧光染色法观察OPC中NG2/EphA4及OLs中CNPase/EphA4共表达情况；采用1.0μmol/L的ASA和等体积无水乙醇处理体外培养的OPC及OLs，通过免疫荧光染色及Western blot法观察EphA4受体表达变化情况；　　结果：1）大鼠脑组织免疫荧光染色结果显示大鼠胼胝体部EphA4+细胞可与NG2+细胞、CNPase+细胞共标；2）细胞免疫荧光染色结果显示OPC中EphA4+细胞可与NG2+细胞共标，OLs中EphA4+细胞可与CNPase+细胞共标；1.0μmol/LASA处理组与对照组相比，EphA4+/NG2+双标阳性OPC和EphA4+/CNPase+双标阳性OLs数量均明显减少，差别具有统计学差异（P＜0.05）；Western blot结果显示与对照组相比，1.0μmol/LASA处理组的EphA4表达水平下降，差别具有统计学差异（P＜0.05）；　　结论：EphA4受体可表达于OPC及OLs上，且其表达可被ASA抑制。　　实验二：抑制EphA4受体活性对阿司匹林治疗WML模型大鼠的影响　　目的：研究EphA4受体抑制剂（EphA4-FC）对ASA治疗WML模型大鼠的影响；　　方法：CCAO法制作WML大鼠模型，采用生理盐水、25mg/kg/dASA、EphA4-FC（侧脑室注射250nM）、25mg/kg/dASA+EphA4-FC（侧脑室注射250nM）干预四周后，通过免疫组织化学染色法观察胼胝体部NG2、CNPase阳性细胞的表达情况，通过Western blot检测PDGFαR、MBP的表达变化，通过电镜观察分析髓鞘结构变化情况；　　结果：1）免疫荧光染色结果显示WML模型大鼠胼胝体部NG2+细胞较正常组增多，而CNPase+细胞较正常组明显减少，经过ASA、EphA4-FC、ASA+EphA4-FC干预后NG2+和CNPase+细胞数均增多，差别具有统计学差异（P＜0.05）；ASA与EphA4-FC两组增高情况相同，差别不具有统计学差异（p＞0.05）；而对ASA治疗同时给予EphA4-FC后发现， ASA+EphA4-FC处理组较ASA及EphA4-FC处理组NG2+和CNPase+细胞数进一步增高，差别具有统计学差异（P＜0.05）；2）Western blot结果显示对照组 PDGFαR的表达较正常组升高，而经过 ASA、EphA4-FC、ASA+EphA4-FC干预后PDGFαR的表达较对照组均升高，同时ASA+EphA4-FC处理组升高更加明显，差别具有统计学差异（P＜0.05）；对照组MBP的表达较正常组降低，经过ASA、EphA4-FC、ASA+EphA4-FC干预后MBP表达明显升高，且ASA+EphA4-FC处理组升高更加明显，差别具有统计学差异（P＜0.05）；3）电镜结果显示对照组较正常组髓鞘厚度降低，板层分离明显，G-ratio比值增高；经过ASA、EphA4-FC、ASA+EphA4-FC干预后髓鞘厚度增加， G-ratio比值降低，且ASA+EphA4-FC组变化更加明显；　　结论：抑制EphA4受体可以促进WML模型大鼠胼胝体部OPC增殖、分化及髓鞘形成；同时加强ASA对WML模型大鼠的治疗作用。　　实验三：抑制EphA4受体活性对阿司匹林促进OPC增殖分化的影响　　目的：研究EphA4受体抑制剂（EphA4-FC）对ASA促进OPC增殖、分化的影响；　　方法：采用1.0μmol/L的ASA、EphA4-FC（250nM）、1.0μmol/L的ASA+EphA4-FC（250nM）和等体积的无水乙醇处理体外培养的OPC及OLs，通过免疫细胞化学染色法观察NG2/Ki67双标阳性细胞以及CNPase阳性细胞的表达情况，通过Western blot检测PDGFαR、MBP的表达变化；　　结果：1）免疫荧光染色结果显示体外培养OPC及OLs经过ASA、EphA4-FC、ASA+EphA4-FC干预后与对照组相比，NG2+/Ki67+双标阳性的新增OPC数量增多，且ASA+EphA4-FC组增多更明显，差别具有统计学差异（ P＜0.05）；同样，与对照组相比， CNPase+的 OLs数量也增多，且ASA+EphA4-FC组增多更明显，差别具有统计学差异（P＜0.05）；2）Western blot结果显示各处理组PDGFαR、MBP的表达均较对照组升高，差别具有统计学差异（p＜0.05）；　　结论：抑制EphA4受体可以促进体外培养OPC的增殖、分化；同时加强ASA促进OPC增殖、分化的作用。　　实验四：抑制EphA4受体活性对ERK及RhoA信号通路的影响　　目的：最新研究表明，ASA可以调控ERK及RhoA信号通路，且前述实验证实ASA可抑制EphA4。本实验研究EphA4受体抑制剂（EphA4-FC）对ERK和RhoA信号通路的影响；　　方法：1）按照实验二分组和处理方法获取各组脑组织蛋白，通过Western blot检测各组ERK/p-ERK及RhoA表达变化；2）按照实验三分组和处理方法获取各组细胞蛋白，通过Western blot检测各组ERK/p-ERK及RhoA表达变化；　　结果：1）组织Western blot结果显示对照组p-ERK表达较正常组下降，而ASA、EphA4-FC、ASA+EphA4-FC处理后p-ERK表达较对照组及正常组均显著升高，差别具有统计学差异（P＜0.05），总ERK水平在各组间无差异；而RhoA活性变化与ERK相反，对照组 RhoA活性较正常组大幅升高，而经 ASA、EphA4-FC、ASA+EphA4-FC处理后下降至正常水平，差别具有统计学差异（P＜0.05）；2）细胞Western blot结果显示各处理组p-ERK表达均较对照组升高，差别具有统计学差异（P＜0.05），总ERK水平在各组间无差异；而各处理组RhoA活性均较对照组下降，差别具有统计学差异（P＜0.05）；　　结论：抑制EphA4受体活性可以激活ERK同时抑制RhoA信号通路。