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目的临床上,周围神经损伤后的轴突生长不仅扮演着重要的角色,也是目前面临的难题。周围神经损伤后,主要表现为轴突连续性的中断,导致了神经炎症反应和神经轴突信号传递的缺失,最终致使患者感觉和运动功能的丧失。众所周知,炎症反应是调控神经轴突再生的重要因素之一。核因子κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)作为经典的炎症因子参与到许多的炎症反应,并在其中起着重要的调控作用。然而,NF-κB在成年哺乳动物的感觉神经元轴突再生作用却是未知的。信号转导转录因子3(signal transductionoftranscriptionfactor,STAT3)同样具有调控炎症因子的合成及释放,在神经轴突再生具有一定的作用。在此,我们发现周围神经损伤后,NF-κB和STAT3均在成年感觉神经元中激活。此外,药物抑制NF-κB和STAT3的表达均可阻碍周围感觉神经元在体外及体内的轴突生长;相反,激活NF-κB后,体外轴突再生未表现出明显促进作用,而激活STAT3则可促进神经轴突的再生。此外我们还发现STAT3的激活显著促进视神经的体内再生,并在一定程度上提高了视网膜神经节细胞的存活率。更重要的是,激活STAT3可以逆转由于NF-κB受抑所引起的轴突生长受阻。综上所述,本研究表明NF-κB通过STAT3调节成年感觉神经元轴突生长。方法1.本课题研究采用外周神经损伤模型,于损伤1、3、7天后取背根神经节(dorsal rootganglion,DRG),对感觉神经元中NF-κB及STAT3的蛋白表达进行蛋白质免疫印迹(Western Blot)定量检测。2.体外应用DRG感觉神经元培养模型,通过特异性的化学药物及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制NF-κB及STAT3的蛋白表达,体外培养3天后,经特异性神经元标记抗体进行免疫荧光染色,标记神经元再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。3.体外DRG感觉神经元培养,通过特异性化学激活剂激活NF-κB及STAT3的活性表达,体外培养2天后,使用特异性神经元标记抗体通过免疫荧光染色标记再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。4.体内DRG电穿孔转染特异性siRNA与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)混合溶液至腰椎4、5(Lumbar4～5,L4～5)抑制NF-κB及STAT3的活性,2天后行坐骨神经夹伤,5天后取出夹伤侧坐骨神经进行压片,统计测量被GFP转染标记的神经元再生轴突,以此检测两者在体内对轴突再生的功能作用。5.利用玻璃体注射及视神经损伤模型,将20%乙醇或STAT3特异性激活剂注射进入玻璃体并同时进行视神经损伤。术后12天再次注射Alexa-488标记的霍乱毒素B(Alexa-488-CTB)进入眼球玻璃体内顺行标记再生轴突。术后14天使用4%多聚甲醛固定视神经并通过10%、20%、30%蔗糖梯度脱水处理。冰冻切片后,测量统计视网膜神经节细胞的存活率及视神经轴突再生情况。6.利用视神经损伤模型,于损伤后14天,取出视网膜,冰冻切片后,通过特异性神经元免疫荧光染色统计视网膜神经节细胞的存活率,以此确定激活STAT3在一定程度上促进节神经元的存活。结果1.NF-κB调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内p-p65蛋白表达逐渐升高,且在第3、7天最为明显。2)药物PDTC抑制NF-κB活性,或转染p65小干扰RNA敲减其蛋白,阻碍了体外培养的DRG感觉神经元轴突的生长。3)p65小干扰RNA体内电转染至L4/L5 DRG内,敲减NF-κB蛋白后,坐骨神经轴突再生受到抑制。4)相反,药物VP16虽促进了磷酸化p65表达升高,但体外感觉神经轴突的生长未表现出明显的增长。2.STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内磷酸化STAT3表达在第一天达到高峰,此后呈现逐渐降低趋势。2)药物S3I-201抑制STAT3活性,或转染siRNA敲减其蛋白,体外培养的DRG感觉神经元轴突再生受到阻碍。3)特异性STAT3小干扰RNA电转染至L4/L5 DRG感觉神经元中,坐骨神经轴突的生长受抑。4)药物CLN不仅促进了磷酸化STAT3表达明显升高,还可显著促进成年感觉神经元的轴突再生。5)玻璃体内注射CLN激活STAT3活性,既促进视神经轴突的生长,也提高了视网膜神经节细胞的存活率。3.NF-κB通过STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)通过PDTC抑制NF-κB活性后,不仅能降低p-p65,还能致使p-STAT3表达降低。2)使用CLN激活STAT3活性,可在一定程度上逆转NF-κB抑制剂所带来的阻碍感觉神经元轴突再生的作用。结论外周神经损伤后轴突再生的过程比较复杂,它受体内多种基因严格的联合调控。一般情况下,神经损伤后常伴随炎症反应及相关转录因子的激活,以此来调控损伤后轴突再生所需的必要物质。本研究结果表明,NF-κB及STAT3均具有调控感觉神经轴突再生的功能,且揭示了 NF-κB能通过调节STAT3进一步调控轴突再生。更为重要的是,激活STAT3不仅能促进视神经受损后的轴突再生,还可在一定程度上提高视网膜神经节细胞的存活率。