对外来入侵植物进行病原真菌的调查和菌株分离,开发强致病性菌株对其进行生物防治是控制外来入侵植物的较好方法。在对外来恶性入侵杂草加拿大一枝黄花生物防治的研究过程中,从其罹病植株上分离得到齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)菌株SC64,该菌为该植物上首次报道。本文主要进行了如下探索：1.加拿大一枝黄花和其他植物白绢病病原菌的分离和鉴定。在加拿大一枝黄花、草坪苔藓、吊兰、花生和秋海棠5种寄主上发现了引起其萎蔫、枯萎的病原菌,分离得到的菌株经形态学鉴定为齐整小核菌,将其分别编号为SC64、CSC、DSC、HSC和QSC。运用真菌通用引物ITS1和ITS4从5种齐整小核菌的基因组DNA中分别扩增出684、687、681、685和665 bp的片段,序列与Genbank中的大多数齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)同源性99.5%。菌株SC64侵染加拿大一枝黄花的循环过程主要以菌核形式越冬翌年萌发菌丝成为侵染源。齐整小核菌引起加拿大一枝黄花病害在我国为首次报道,菌株SC64有可能开发作为生物除草剂防除加拿大一枝黄花及其他阔叶杂草的候选菌株。2.菌株SC64的寄主范围。共测试了29个科的105种植物对齐整小核菌菌株SC64的敏感性。测试结果表明大多数双子叶植物纲的植物和4种单子叶植物纲植物大蒜、异型莎草、鸭跖草和饭包草(共计78种)对菌株SC64敏感,草坪草和禾本科作物则无病害产生。敏感寄主多集中于菊科、玄参科、旋花科和豆科；而藜科、禾本科及商陆科的植物对菌株SC64完全不敏感,苋科、蓼科及伞形科的部分植物对菌株SC64敏感。3.齐整小核菌菌株SC64的侵染过程。(1)在加拿大一枝黄花茎上,接种了菌丝体悬浮液的茎段约12 h即布满病菌菌丝。在单条菌丝末端观察到略微的膨胀并形成附着器,该结构充当了侵染垫的功能。侵染菌丝通常直径和体积较大,能分泌黏液和压迫破坏寄主表皮,且一条侵染菌丝可形成数个侵染垫结构。侵染菌丝在形成侵染垫后即分化形成较小的分枝菌丝,此后开始萎缩和消亡。侵染发生于侵染垫周围被破坏的表皮组织,由分枝菌丝进入寄主。总体说来病菌的侵染过程包括：茎表面由单菌丝体顶端膨大形成侵染垫,寄主表皮的机械直接侵入,侵染菌丝的细胞间扩展及分枝菌丝的胞间胞内扩展。在整个作用过程中,侵染结构形成是侵入的关键,机械压力起着重要的辅助作用。(2)利用普通显微染色法和扫描电镜观察了齐整小核菌菌株SC64在异型莎草茎上的侵染过程,并比较了菌株在异型莎草和其他6种莎草属植物茎基部上的侵染差异。结果显示菌株SC64有两种方式侵入异型莎草：一是菌丝通过波纹状伸展越过寄主表面的脊而到达气孔部位进入寄主；二是通过分泌某些物质破坏寄主表面后从裂隙直接进入寄主。异型莎草的气孔分布以及气孔下方的组织结构与其他6种莎草属植物存在显著差别,其气孔通常位于两叶脉之间部位,距脉3-4排细胞,气孔下方有较大的气腔。这种没有叶脉机械阻力可能是异型莎草区别与其它莎草受侵染的主要原因。4.菌株SC64的生物学特性。主要研究了影响齐整小核菌菌株SC64营养生长、菌核萌发的因素。结果表明：菌株最适生长培养基为Richard固体培养基和PDA,在偏酸性条件下生长较好,适宜pH值为4.0-6.0,最适为5.0；菌丝生长温度为15-40℃,最适30℃；在所测试的碳源中,对蔗糖的利用最好,对乳糖和半乳糖利用最差；氮源测试结果显示对蛋白胨和硝酸钾利用最好,对尿素的利用最差；菌核萌发温度为15～40℃,最适宜30℃；菌核在含水量≥50%的麸皮基质上萌发较好；适宜萌发的pH值范围为3.0-9.0；菌丝的致死温度为45℃10 min,菌核的抑制萌发温度为50℃10min。5.菌株SC64液体菌种培养的影响因素。主要研究液体菌种培养过程的环境因子及3种草酸前体物质(柠檬酸、抗坏血酸及琥珀酸)对液体发酵菌丝体生物量、草酸积累量及菌液致病力的影响。试验结果显示优化Richard液体培养基(MRS)产生最大的菌丝体生物量,但马铃薯液体培养基(PDB)最利于草酸的积累且菌液对离体加拿大一枝黄花叶片具有最大致病力。以PDB为基础培养基,接种4d其单位菌丝体产生最大草酸；27℃最有利于草酸积累,但30℃下菌丝体生物量和菌液致病力最强；草酸积累的适宜pH值范围在4.0-6.0,最适5.0,菌丝体生长的适宜pH值范围在3.5-6.0,最适5.0,产生最强致病力的适宜pH值范围在3.5-5.5,最适3.5。添加3种草酸前体物质后菌丝体生物量和草酸积累均出现下降趋势,其中添加琥珀酸钠引起的下降幅度最大。关于最佳菌丝体生长量及最佳草酸积累量的试验结论将对菌株SC64的进一步开发利用提供理论依据。6.菌株SC64在农业废弃固体基质的培养和应用。主要研究了利用不同农业废弃固体基质对齐整小核菌菌株SC64的培养效果,含菌丝体固体基质的储藏检测、室内模拟土壤不同土壤环境的活化效果,以及在温室条件下对杂草的防除效果,试图寻找大批量生产以及利用该菌的方法和条件。结果表明,在测试的12种固体基质中,以麸皮和棉籽壳培养的菌丝体密度和致病力最强,菌丝长满基质时草酸产量分别为6.06和5.94 mg·g-1; 5 mm菌体颗粒对离体紫茎泽兰叶片的致死面积分别为2.78和2.73 cm2。以棉籽壳培养的菌体基质为例,萌发的菌丝在土壤含水量25%、pH 5及25℃具有最大土壤表面扩展半径；在土壤含水量20%、pH 7及30℃具有最大土壤内部扩展半径,新培养的菌核在土壤含水量15%、pH<6及25℃具有最大萌发率,但都小于60%；含菌丝体棉籽壳基质最适宜的储存温度为20℃,基质初始含水量40%。将有机肥基质(棉籽壳菇渣废料)按照40%(%w)添加到麦稃基质,或将麸皮基质按照50%(%w)添加到稻壳基质,可以达到棉籽壳培养相当的效果。基质湿度对发酵有明显影响,有机肥-麦稃复合基质的初始料水比在100-110%之间最好,麦麸-稻壳复合基质的初始料水比在30%最好。以稻壳-麸皮(2：1,v/v)培养的菌体基质温室条件下使用剂量120 g.m-2时,7 DAI对异型莎草、鳢肠、豚草、陌上菜和加拿大一枝黄花等杂草的株防效在70.5-87.7%,最大鲜重防效在78.7-91.6%；对反枝苋苗前土壤处理的最大株防效和鲜重防效分别为47.0%和58.5%；苗后7叶期处理的最大株防效和鲜重防效分别为84.4%和76.3%。对禾本科杂草马唐苗前土壤处理的株防效和鲜重防效分别为41.6%和45.2%；苗后2叶期处理的株防效和鲜重防效分别为14.3%和25.9%。7.影响含菌丝体固体基质致病力的环境因子。以鳢肠为例,通过盆栽试验研究了杂草叶龄、不同接种量以及温度、土壤湿度、保湿期时间等环境因子对菌株SC64致病力的影响。进一步温室条件下模拟了旱直播水稻田环境下菌株SC64防治节节菜、异型莎草、鸭舌草和耳叶水苋的试验。结果表明,鳢肠幼苗在5叶期以下,接种含菌丝体固体基质剂量在100 g·m-2以上,温度范围27～33℃,土壤相对饱水90%左右,并且接菌后湿度保持至少24 h,是菌株SC64达到理想除草效果的必需条件。接种含菌丝体固体基质剂量在120 g·m-2时,28 d可以引起节节菜和鸭舌草80%和75%的植株死亡率及84%和83%的鲜重抑制率；对异型莎草和耳叶水苋的防效稍差,致约50%的植株死亡率及60～65%的鲜重抑制率。这表明菌株SC64具有开发作为生物除草剂应用于夏季作物田控制阔叶杂草的潜力。8.菌株SC64的田问控草效果。(1)田间测试了菌株对异型莎草、陌上菜、节节菜、水苋菜和鳢肠等杂草的防除效果,并模拟检测了菌核在土壤中的残留和越冬能力。试验包括2008/10的两次网室小区试验和2010年南通市两个试验点的大田试验。主要检测了使用含菌丝体基质7d和14d后杂草的株防效及鲜重防效。南通试验点结果显示首次施用14天后的杂草株防效和鲜重防效分别为30～60%和31-59%,再次施用后可上升到39～86%和42-90%。由于杂草基数较小和施用时适宜的天气,如皋试验点施用一次的杂草株防效和鲜重防效分别为42～77%和52-82%。菌核在土壤水分饱和的情况下60 d后,即完全失去萌发能力。试验结果说明了齐整小核菌菌株SC64具有开发做为生物除草剂用于旱直播稻田防除阔叶杂草的潜力。(2)为寻求一种快速的非化学防除手段控制加拿大一枝黄花,设计了割除、翻耕以及使用齐整小核菌菌株SC64田间评价试验以及在加拿大一枝黄花的不同生长季节、不同处理方式单独使用或复合使用等不同防除方式的试验。结果表明,单一的割除、翻耕、或使用菌株SC64均不能很好的防除加拿大一枝黄花,将割除、翻耕后结合使用菌株SC64,5月、7月、9月的野外防除试验均杀死了90%以上的加拿大一枝黄花。该种复合处理方式不但消灭了加拿大一枝黄花的地上部分,同时也杀死了其地下根状茎,还杜绝了种子的形成。(3)研究了齐整小核菌菌株SC64一次性用于刺儿菜的防除及应用于3种禾本科草坪防除阔叶杂草的效果。结果表明当使用剂量100 g·m-2时14 DAI可分别引起刺儿菜75%和88%的株防效和鲜重防效。以此剂量在高羊茅、百慕大、马尼拉3种草坪一次施用可使主要阔叶杂草的密度降低80%以上,且对草坪草安全,这进一步显示了将该菌研制成生物除草剂的潜力。(4)研究了齐整小核菌菌株SC64在温室及田间试验条件下用作苗前土壤处理防除玉米田杂草马唐和反枝苋以及旱直播水稻田鳢肠和其他阔叶杂草的效果。温室盆栽模拟玉米田的试验结果表明当直接将含菌丝体固体基质(60～140g.m-2)应用到土壤中21 DAI仅能分别引起20～35%和22～35%的杂草株防效和鲜重防效。当向土壤表层添加麦秸秆碎屑的添加量模拟试验结果显示,将常规田间麦秸秆产量及其2倍量与土壤混匀后,施用100 g·m-2菌体基质可分别引起马唐和反枝苋47%、63%株防效和47%、68%的鲜重防效。田间的小区试验结果显示了类似株和鲜重防效。在麦秸秆还田的条件下,2011年夏天在南通进行了齐整小核菌菌株SC64含菌丝体固体基质在旱直播稻田的苗前土壤处理大田试验,结果显示施用28天后的杂草株防效和鲜重防效分别为51～78%和45～75%。上述试验过程中玉米和水稻的出苗及生长速率均没有受到影响。试验结果说明在结合秸秆还田技术的基础上,齐整小核菌菌株SC64具有用作苗前土壤处理防除杂草的潜力。综上所述,本文主要研究了菌株SC64的寄主范围、侵染过程、生物学特性、液体菌种培养、利用农业废弃固体基质采用固一液联合发酵对其进行大批量培养,并以含菌丝体固体基质为应用材料进行侵染的影响因子、温室及田间应用等方面的试验,系统评价了菌株SC64开发作为生物除草剂的潜力,为禾本科作物田、草坪的阔叶杂草以及环境中的加拿大一枝黄花的生物防治提供新的方法和思路。