一、目的与意义X射线在人类生活中无处不在,既有来自于外太空的自然本底辐射,同时,在医疗领域中,X射线被广泛应用于疾病的诊断及治疗。X射线能够穿透包括人体组织在内的多种物质,造成组织发生病理性损伤,造成这种损伤的主要机制是由于电离辐射通过在细胞中产生大量自由基而造成的。随着科学技术的发展,电离辐射在各个领域的应用愈加广泛,辐射带来的危害越来越受到人们的关注,特别是X射线对生殖系统的影响。因此,探索X射线影响女性生殖能力的机制及寻找更为有效的辐射保护剂显得尤为重要。胚胎着床是一个极为复杂的生物学过程,不但需要子宫内膜具有良好的接受态,也需要卵巢具有正常的排卵功能及规律的激素分泌,其中,任何一个环节出现功能失调都会导致不孕症的发生。研究发现,卵巢中过量的ROS(Reactive Oxygen Species)聚集会导致卵巢颗粒细胞发生凋亡,影响正常排卵及激素分泌。当子宫组织自身抗氧化能力下降时,其生长会受到抑制。已有报道表明:线粒体与溶酶体在细胞衰老的过程中发挥重要作用。目前,关于X射线通过氧化性损伤影响女性生殖系统功能是否与线粒体及溶酶体功能损伤相关尚未见报道。自噬是广泛存在于真核细胞中的生理现象,正常情况下,细胞内的自噬水平较低,当受到外界刺激时,自噬水平会增加,利用溶酶体的吞噬作用降解细胞内的毒物,利于细胞的存活。然而,当自噬水平过高时,会造成细胞的死亡。研究表明,ROS在细胞的自噬过程具有调控作用。然而,自噬在X射线影响子宫内膜接受态的过程中发挥何种作用及相关信号通路尚需要进一步研究。n-乙酰半胱氨酸(n-acetycysteine,nac),是一种含有活性巯基(-sh)的分子,可抑制或减少不同原因造成的组织氧化性损伤。nac作为细胞内还原性谷胱甘肽的前体分子,是一种常用的抗氧化剂。已有一些研究表明,nac作为一种粘痰溶解药物在临床上被广泛应用已有四十多年的历史。然而nac是否能应用于电离辐射暴露引起的女性生殖系统损伤的保护仍未见报道。本文通过体内与体外实验,分别探讨x射线对人子宫内膜细胞的氧化性损伤机制,x射线引起人子宫内膜细胞中发生自噬的途径,自噬在子宫内膜接受态损伤过程中发挥的作用,及nac对x射线诱导小鼠卵巢发生功能衰竭过程中的保护作用和机制。本文的研究有助于探讨电离辐射影响女性生殖健康的分子机制,并为nac在电离辐射造成女性不孕症的治疗中提供新的实验依据。二、实验方法(一)x射线通过影响溶酶体及线粒体功能导致人子宫内膜细胞内dna氧化性损伤影响其功能1.rl95-2细胞进行2gy的x线照射及nac,nh4cl和抑胃肽a(pepstatina,pepa)预处理;2.cck-8检测人子宫内膜上皮细胞(rl95-2)存活率;3.利用透射电镜及扫描电镜观察rl95-2细胞内外部形态变化;4.利用体外胚胎粘附模型检测rl95-2细胞对人滋养层细胞(jar)的接受性;5.利用罗丹明123荧光染色法进行rl95-2细胞线粒体膜电位的检测;利用westernblot检测细胞质中细胞色素c(cytochromec,cytc)从线粒体中释放的情况;6.利用lyso-trackerred荧光染色法进行rl95-2细胞溶酶体膜稳定性的检测;利用westernblot检测细胞质中组织蛋白酶d(cathepsind,cd)从溶酶体中释放的情况;7.利用dcfh-da荧光染色法进行rl95-2细胞细胞内ros生成的检测;利用免疫荧光检测细胞中8-羟基脱氧鸟苷(8-ohdg)形成;8.利用彗星实验,免疫荧光及激光共聚焦和westernblot分别检测rl95-2细胞dna断裂和磷酸化组蛋白(γh2ax)的表达水平。(二)x射线通过生成ros引起人子宫内膜上皮rl95-2和hec细胞自噬的途径和意义1.细胞进行2gy和10gyx射线照射及nac,3-ma预处理;2.westernblot检测凋亡及增殖相关蛋白的表达;利用流式细胞术检测细胞凋亡的情况;3.扫描电镜观察细胞内自噬小体的形成;westernblot检测自噬相关蛋白的表达;lysotrackerred及mdc荧光染色法检测细胞内自噬水平;4.dcfh-da荧光染色法检测细胞内ros的形成;5.westernblot检测mapks信号通路的激活;6.抑制自噬后利用体外胚胎粘附模型检测rl95-2细胞对人滋养层细胞(jar)的接受性;利用集落形成实验绘制细胞存活曲线。(三)nac对x射线导致小鼠卵巢功能衰竭中的保护作用1.小鼠进行nac预处理及3gyx射线全身照射;2.elisa分析照射后小鼠血清中雌激素,孕激素,抗穆氏管荷尔蒙及促卵泡生成素的表达水平;3.小鼠卵巢称重检测卵巢重量变化;4.he染色观察卵巢中各级卵泡形态的变化;5.westernblot及免疫组化检测卵巢组织中pcna的表达水平;6.免疫组化检测卵巢组织中cytc和caspase-3的表达水平;tunel实验检测卵巢组织中凋亡的水平;7.利用总谷胱甘肽检测试剂盒检测卵巢组织中gsh水平;利用免疫组化检测8-ohdg的表达;8.扫描电镜观察子宫内膜吞饮泡的形成;h&e染色观察子宫内膜上皮形态学变化;雄雌鼠交配后,统计交配率,受精率及胚胎粘附率。三、结果(一)x射线通过影响溶酶体及线粒体功能导致人子宫内膜细胞内dna氧化性损伤影响其功能1.x射线降低rl95-2细胞存活率,细胞呈衰老趋势,细胞表面微绒毛增加;rl95-2细胞与jar细胞间的粘附率下降;2.x射线降低线粒体膜电位及溶酶体膜稳定性;3.x射线诱导细胞内发生氧化应激及dna的氧化性损伤;4.x射线诱导细胞内dna发生双链断裂;5.细胞经过nac,nh4cl及pepa预处理后,能够不同程度的保护溶酶体与线粒体功能,降低氧化应激水平及dna损伤,并且促进jar与rl95-2细胞的粘附。(二)x射线通过生成ros引起人子宫内膜上皮rl95-2和hec细胞自噬的途径和意义1.x射线促进细胞凋亡;2.x射线造成细胞内发生自噬;3.nac预处理后经x射线照射,细胞内的自噬水平显著降低;4.x射线通过激活jnk信号通路引起自噬,nac预处理抑制jnk信号通路;5.抑制自噬会增加细胞内的凋亡水平,减少rl95-2和hec细胞与jar细胞间的粘附,增加细胞对射线的敏感性。(三)nac对x射线导致小鼠卵巢功能衰竭中的保护作用1.x射线导致小鼠卵巢重量减轻;2.x射线减少小鼠血清中雌激素,孕激素及抗穆氏管荷尔蒙的表达,增加促卵泡生成素的表达;3.x射线显著减少卵巢中原始卵泡,初级卵泡的形成,对腔前卵泡影响不显著,会增加闭锁卵泡的形成;4.x射线影响子宫内膜形态,产生不规则形态;显著抑制子宫内膜上皮中吞饮泡的形成;显著影响雌鼠生育能力;5.x射线抑制卵巢颗粒细胞增殖,促进凋亡;6.x射线诱导卵巢细胞中发生氧化应激;7.nac预处理显著恢复卵巢的卵泡形成,激素分泌,减少氧化应激水平,抑制凋亡,促进增殖,改善子宫内膜形态与功能,在一定程度上恢复胚胎粘附。四、结论(一)x射线通过影响溶酶体及线粒体功能导致人子宫内膜细胞内dna氧化性损伤影响其功能1.x射线造成溶酶体及线粒体功能下降;2.溶酶体线粒体功能的下降导致氧化性dna损伤;3.线粒体-溶酶体轴在氧化损伤中发挥作用;4.抗氧化剂NAC及溶酶体保护剂NH4Cl和Pep A对X射线造成的RL95-2细胞损伤均有保护意义并且改善细胞功能。(二)X射线通过生成ROS引起人子宫内膜上皮RL95-2和HEC细胞自噬的途径和意义1.X射线通过增加细胞内ROS引起自噬;2.ROS通过激活JNK信号通路引起自噬;3.自噬在X射线造成细胞损伤中起保护作用。(三)NAC对X射线导致小鼠卵巢功能衰竭中的保护作用1.3 Gy X射线全身照射会造成小鼠卵巢呈早衰样病变,并影响小鼠生殖能力;2.NAC通过抑制氧化损伤,降低颗粒细胞的凋亡,促进颗粒细胞增殖,进而改善卵巢排卵,储备及激素分泌功能;3.NAC具有改善小鼠生育能力的作用。4.NAC具有可做为抗辐射试剂保护女性生殖系统功能的潜力。