背景和目的早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）是指女性在40岁以前出现卵巢功能减退,不能产生正常量的雌激素或定期排卵,造成不孕,严重影响女性生殖健康。POI病因较为复杂,大部分为特发性POI。DIA（data independent acquision,DIA）蛋白质组学因其高通量、精确性高、可重复度高的优点引起了广泛的关注。DIA蛋白质组学技术成熟的应用可以帮助深入探究POI患者颗粒细胞的差异蛋白在疾病中的作用,为POI的发生、发展及早期诊断提供更多线索。方法1.募集2018年6月-2019年12月就诊于南方医科大学南方医院5例行IVF/ICSI-ET助孕的生化异常期POI患者,对照组5例,留取颗粒细胞,利用DIA蛋白质组学技术构建颗粒细胞表达谱,对差异蛋白进一步做生物信息学分析。2.扩大样本量,留取颗粒细胞,提取RNA和蛋白,对鉴定到的可能跟POI相关的蛋白 RAC1、RHOA、PRKACA、MARCKS,利用 qRT-PCR 技术和 Western Blot技术进行验证。3.在颗粒细胞系KGN和COV434构建RAC1敲低模型,利用CCK8、EdU、流式细胞术实验探究RAC1敲低后对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。在敲低RAC1的KGN细胞和加入RAC1酶活性抑制剂NSC23766的人黄素化颗粒细胞hLGC中检测E2的表达水平。用Western Blot检测相关通路蛋白的表达以探究其具体的作用机制。结果1.差异蛋白质组学鉴定到41613个肽段,共2688个蛋白,其中差异蛋白有70个。这些差异蛋白中共有高表达蛋白9个,低表达的蛋白为61个。2.生物信息学分析结果表明:差异蛋白主要参与细胞遗传物质的组成,并且参与细胞过程和人类炎症疾病的通路等。3.对上述可能参与生殖过程四个下调蛋白RAC1、RHOA、PRKACA和MARCKS进一步进行验证,大部分POI组颗粒细胞中RAC1、RHOA、PRKACA、MARCKS的mRNA和蛋白表达下调。4.颗粒细胞KGN和COV434中下调RAC1的表达抑制了细胞增殖,细胞周期阻滞在G1/G0期且对颗粒细胞的凋亡具有促进作用;敲低RAC1后KGN和COV434 中的 β-catenin、Cyclin D1 下调,P21、Bax 上调;敲低 RAC1 的 KGN细胞或者加RAC1酶抑制剂的hLGC抑制了 E2的合成,且芳香化酶和FSHR的表达降低。结论1.本研究首次利用基于DIA的定量蛋白质组学技术,对生化异常期的POI患者颗粒细胞进行了差异蛋白的鉴定,成功建立了 POI与对照组的颗粒差异蛋白表达谱。2.RAC1、RHOA、PRAKCA、MARCKS蛋白可能在POI疾病中发挥作用,是潜在的POI标志物。3.RAC1可能是通过β-catenin通路,影响了颗粒细胞的增殖、凋亡过程,且可能通过影响芳香化酶和FSHR表达,从而影响E2合成,最终影响了整个POI发展进程。