H5N1亚型禽流感病毒(fdvifdl]int]uenZa vims，AIv)不仅可以感染禽类，而且可以跨越种属屏障感染人或其他哺乳动物，严重威胁人类健康。自1997年高致病性H5N1亚型禽流感病毒跨越种属屏障直接感染人，至2011年2月已有525例感染发病，310例死亡，死亡率大约60％，成为目前令人十分恐惧的病原体之一，至今，H5N1禽流感病毒对人感染和致病的机制尚不完全清楚。蚀斑是病毒感染细胞形成的重要特征之一，不同的H5N1病毒株蚀斑特性不同，同一人源H5N1病毒株经过传代后，蚀斑的形态、形成大小也会发生改变。同一来源H5N1病毒株中的不同蚀斑类型病毒，它们的基因序列差异较小，如果不同蚀斑病毒株之间存在致病性差异，较易分忻病毒致病性差异的分子基础。本研究的目的是从H5N1禽流感病毒株A厂＼，ietIlam／1194／2004(H5N1) (简称vNll94)蚀斑形成特性入手，利用禽流感病毒在哺乳动物细胞或实验动物传代过程中发生蚀斑大小改变的特性，首先分离纯化蚀斑大小不同的病毒，再感染小鼠观察分离纯化的病毒对小鼠致病力的差异，然后通过致病力差异毒株全基因组序列分忻找出差异基因位点，并利用反向遗传学技术进行进一步验证，探讨H5N1禽流感病毒致病力的分子基础，为禽流感病毒致病分子机制研究探索一条新的思路。一、致病力差异毒株的分离和序列分析本研究首先建立了H5N1禽流感病毒蚀斑测定方法，病毒的蚀斑形成测定发现野生型vNll94形成的蚀斑为大小均一的针尖样小斑。接着将vNll94病毒滴鼻感染小鼠传代，取感染组织中的病毒进行蚀斑形成测定，结果显示，在小鼠肺组织的病毒蚀斑特性发生明显的变化，形成大小不均一的混合斑，而在脑组织的病毒蚀斑依然为均一一致的针尖样小斑。之后，通过蚀斑分离纯化技术从肺组织和脑组织中分离得到大斑和小斑病毒，为了观察从不同组织分离纯化的蚀斑形态不同的病毒的致病力是否存在差异，将分离纯化的病毒分别感染小鼠，鉴定病毒对小鼠的毒力。实验证明从鼠肺分离的大斑病毒(MLLl和MLL4分离株)为致病力弱毒株，而从鼠脑分离的小斑病毒(MBl和MB2)为致病力最强毒株。通过病毒全基因组序列测定，对比致病力差异毒株的基因序列和编码蛋白的氦基酸序列，发现上述4株亚克隆病毒部有氦基酸位点的突变，PB2 163T(PB263位氦基酸由I突变为T)和PBl T677M(PBl 677位氦基酸由T突变为M)为弱毒株MLLl和MLL4的共有突变，而致病力强毒株没有共有的突变位点。本部分研究，建立了禽流感病毒蚀斑形成测定方法，观察到了vNll94病毒在小鼠中传代后蚀斑性状发生改变和小鼠脑分离病毒均为小斑这些现象。成功从vNll94株感染的小鼠组织中分离得到了蚀斑形态和致病力有差异的多株亚克隆病毒，通过基因组序列和蛋白序列分忻比较，发现了P：B2 163T和PBl T677M是致弱株的共有突变位点，提示这两个突变位点可能与病毒的致病力减弱有关，为下一步研究禽流感病毒致病的分子机制奠定了基础。二、PBl T677M位点和P B2 [63T位点的功能研究为确定}t5N1禽流感病毒PB2 163T位点和PBl T677M位点的功能，本研究采用反向遗传学技术拯救位点突变的病毒。首先建立适合禽流感病毒拯救的8质粒系统，利用该系统对野毒株病毒，单一位点突变株病毒和两个位点联合突变株病毒进行了病毒的拯救。通过鸡胚致死性试验、蚀斑试验、特异PCR及全基因组序列测定方法鉴定拯救病毒，并通过感染小鼠测定拯救病毒对小鼠的致病力。采用8质粒病毒拯救系统，利用反向遗传学技术成功拯救出野毒株(rvNll94)、两个基因位点分别单独突变株(rvNll94：PB2—63T和rvNll94：PBl—677M)和两个位点联合突变株(rvNll94M)4株拯救病毒株。全基因组序列分忻证明获得的4株拯救病毒的基因序列与予页期基因序列一致。拯救病毒对小鼠的致病性试验显示，rvNll94M病毒致病力明显弱于其它3株病毒(rVNll94，rVNll94：PB2—63T和rVNll94：PBl—677M)。rVNll94和rvNll94：PB2—63T毒株对小鼠显示出明显的嗜神经性症状，而rvNll94M和rvNll94：PBl—677M无此症状出现。实验表明，PB2 163T位点和PBl T677M位点联合突变可使It5N1病毒致病力减弱。结果提示，病毒PBl的T677M突变可能与病毒的神经嗜性或者病毒进入小鼠脑内的能力有关。三、联合突变使病毒致病力减弱机制的探讨实验中发现PB2 163T位点和PBl T677M位点联合突变可使病毒致病力减弱，而病毒的致病力与病毒在宿主体内的复制能力相关。为研究联合突变致病力减弱的机制，从多方面，多角度分忻病毒复制能力与病毒致病力的关系。首先，在多株不同组织来源的细胞株上(A549、Neuro一2a和RAW264．7)观察对比了不同位点突变病毒的复制能力方面的差异，结果显示rvNll94M在上述三株细胞的复制能力部低于其他病毒，提示rvNll94M的复制能力较低是导致病毒致病力相对较弱的主要因素之一。接着，在分子水平探讨聚合酶活性与病毒复制能力的关系，结果表明，在聚合酶蛋白亚基PB2和PBl mRNA表达量无差异的条件下，rvNll94M和rvNll94：PB 1—677M这两株病毒的聚合酶活性明显强于其他两株病毒，分忻发现PB2 163T和PBl T677M位点联合突变的病毒复制能力较弱并非是受聚合酶转录活性低的影响，复制能力较弱机制可能还受其它因素的影响。通过滴鼻感染小鼠观察了突变病毒在小鼠肺、脑组织中病毒复制能力的差异，发现rvNll94M感染鼠肺中病毒载量明显低于其他三株病毒，说明病毒在小鼠肺组织中的载量较低是病毒对小鼠致病力较弱的最重要因素。检测感染小鼠脑组织发现，PBl 677M位点突变的病毒(即：rvNll94M和rvNll94：：PBl—677M)感染的鼠脑组织中检测不到病毒，这与我们第二部分这两株病毒感染小鼠临床表现无嗜神经性症状极为吻合，进一步说明，PBl T677M突变可能导致病毒不能进入小鼠脑内。感染宿主的病理损伤程度是病毒致病力强弱的直观证据，本研究利用拯救获得的双位点突变病毒(rvNll94M)和未突变病毒(rvNll94)感染小鼠，观察比较这两株病毒致小鼠组织脏器的病理损伤情况，从病理学角度分忻PB2 163T和：PBl T677M位点联合突变致病毒致病力减弱的机制。结果显示rvNll94M对小鼠肝组织、肾组织和脾组织的损伤明显轻于rvNll94，并且rvNll94M感染的小鼠在脑内没有检测到病毒抗原。由此可见，：PB2 163T位点和PBl T677M位点联合突变致病毒对小鼠的致病力减弱的病理机制主要是由于其对小鼠肝组织、肾组织和脾组织等的病理损伤减轻以及病毒不能进入小鼠脑组织。本研究从ft5N1禽流感病毒株蚀斑形成特性入手，分离纯化得到了致病力差异显著的病毒亚克隆株，通过病毒全基因组序列测定和编码蛋白序列分忻找出了基因及蛋白序列的差异位点，揭示出PB2 163T位点和PB 1 T677M位点联合突变可使病毒致病力减弱。研究结果证明，PB2 163T位点和PB 1 T677M位点联合突变病毒对小鼠的致病力减弱与其在小鼠体内复制能力弱、对小鼠的肝、肾、脾等主要脏器造成的病理损伤轻，以及病毒不能进入脑组织有关。同时发现，PBl T677M位点与病毒能否进入小鼠脑组织有关，为揭示禽流感病毒侵蚀中枢神经系统的机理提供了新的理论依据。本研究为禽流感病毒致病分子机制研究和减毒活疫苗研制开辟了一条新的思路，为进一步深入研究禽流感病毒的致病机制提供了新的实验依据。