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目的探讨血红素加氧酶-1在人气道黏液高分泌细胞信号通路中的调节作用,检测其对黏蛋白5AC表达水平的影响,进一步丰富和完善慢性气道炎症气道黏液高分泌发生机制的理论,为气道黏液高分泌的治疗提供新的理论依据。本研究分为三部分:1、人气道黏液高分泌细胞实验模型的建立2、血红素加氧酶-1对黏蛋白表达的干预作用3、血红素加氧酶-1调节黏蛋白表达的分子机制方法1、培养人支气管上皮细胞株HBE16,加入不同浓度的HNE,ELISA检测MUC5AC表达水平的变化,MTT法测定不同浓度的HNE对HBE16细胞活性的影响。2、MTT法测定不同浓度的Hemin及ZnPPIX对HBE16细胞活性的影响;实验分组:(1)对照组:无血清培养液培养HBE16细胞(2)HNE组:HBE16细胞中加入HNE;(3) Hemin组:先于HBE16细胞中加入Hemin预处理1 h后,再加入HNE;(4)ZnPPIX组:先于HBE16细胞中加入ZnPPIX预处理1 h后,再加入HNE。分组培养24 h后提取各组细胞内的总蛋白,采用ELISA检测各组MUC5AC蛋白的表达水平;细胞免疫化学激光共聚焦显微镜观察各组MUC5AC蛋白表达的情况。3、培养人支气管上皮细胞株HBE16,实验分组:同第二部分。24 h后取样RT-PCR检测各组HO-1、Duox1、EGFR及MUC5AC的mRNA水平;Western blot法检测各组p-EGFR、EGFR、HO-1及Duox1蛋白的表达。结果1、HNE浓度分别为0、10、25、50和100 nmol/L时,HBE16细胞裂解液中MUC5AC的含量分别是(106.71+8.39)μg/mg、(129.52+9.24)μg/mg、(157.50+9.15)μg/mg、(196.36+7.60)μg/mg和(235.84+5.33)μg/mg;HNE浓度分别为0、10、25、50和100 nmol/L时,细胞生存率分别为100%、(92.9+3.1)%、(89.2+4.1)%、(78.6+7.2)%和(63.5+5.0)%。2、Hemin浓度低于100μmol/L时, ZnPPIX浓度低于50μmol/L时,对细胞无明显损伤,随着浓度递增,细胞生存率明显降低。HNE组细胞内MUC5AC蛋白含量为(192.68+4.71)μg/mg,较对照组(104.95+6.82)μg/mg表达明显升高(P<0.01);Hemin组MUC5AC蛋白含量为(155.02+9.87)μg/mg,较HNE组表达减弱(P<0.01); ZnPPIX组MUC5AC蛋白含量为(193.01+3.70)μg/mg,较对照组表达明显升高(P<0.01)。细胞免疫化学激光共聚焦显像示HBE16细胞MUC5AC蛋白正常基础表达主要定位于胞质;HNE组与对照组相比,MUC5AC蛋白表达水平明显升高;Hemin组与HNE组相比,MUC5AC蛋白表达减弱; ZnPPIX组与对照组相比,MUC5AC蛋白表达明显增强。3、HNE组MUC5AC、EGFR、HO-1及Duox1的mRNA水平,p-EGFR、EGFR、HO-1及Duox1的蛋白水平均较对照组显著增高(均P<0.01)。Hemin组与HNE刺激组相比,HO-1 mRNA及蛋白明显增多(均P<0.01),而Duox1、EGFR及MUC5AC的mRNA水平和p-EGFR、EGFR及Duox1的蛋白水平均明显回降(均P<0.01)。ZnPPIX组与对照组相比,HO-1 mRNA及蛋白水平无明显增高(P>0.05),而Duox1、EGFR及MUC5AC的mRNA水平和p-EGFR、EGFR及Duox1的蛋白水平均明显增高(均P<0.01)。结论1、HNE组HBE16细胞MUC5AC蛋白表达水平较对照组明显升高,且HNE可呈浓度依赖性地增强MUC5AC表达;HNE浓度低于50nmol/L时,对细胞无明显损伤,随着浓度递增,细胞生存率明显降低,故后续实验中采用该浓度进行处理。2、HO-1可抑制HNE所诱导的气道MUC5AC高表达,而HO-1的保护作用一旦被其抑制剂ZnPPIX所取消,HNE刺激所导致的MUC5AC高表达又可得以呈示。3、HNE可通过Duox1-ROS-TACE-TGF-α配体依赖途径激活EGFR启动MUC5AC转录表达。4、HNE刺激MUC5AC高表达的同时也可诱导体内HO-1表达增高,发挥一定的抗氧化的制衡效应;而给予HO-1诱导剂Hemin增强后,HO-1水平进一步升高,HO-1可通过下调Duox1的表达水平,阻断Duox1-ROS-TACE-TGF-α-EGFR信号通路,进而抑制MUC5AC的高表达。