背景:乙型肝炎病毒感染是严重的公共卫生问题。据估计,全球慢性HBV感染者约有2.57亿,而中国的慢性HBV感染者约有8600万。慢性HBV感染严重危害人类健康,可逐渐发展为肝炎、肝硬化和肝癌,每年因HBV感染导致的各种终末期疾病死亡约88.7万。目前,临床上用于治疗慢性HBV感染的药物主要分为核苷（酸）类似物和干扰素,然而这两种药物均不能完全清除HBV。因此,研发一种新型抗HBV药物至关重要。我们通过筛查小分子化合物库,发现SIRT6抑制剂OSS₂8167可有效地抑制HBV的复制。本研究利用HBV稳定表达细胞系Hep G2.2.15细胞、HBV感染细胞模型Hep G2-NTCP细胞及HBV转基因小鼠模型全面系统研究了OSS₂8167对HBV复制的影响,并进一步阐明了其发挥抗病毒作用的分子机制。目的:1.在Hep G2.2.15和Hep G2-NTCP细胞中研究SIRT6抑制剂OSS₁28167对HBV复制的影响。2.在HBV转基因小鼠模型中研究OSS₁28167的抗病毒作用。3.阐明OSS₁28167发挥抗病毒作用的分子机制。方法:1.MTS实验分析SIRT6抑制剂OSS₁28167对Hep G2.2.15和Hep G2-NTCP的细胞毒性。2.用100μM浓度的OSS₁28167处理Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞,Real-time PCR和southern blot检测OSS₁28167对HBV core DNA水平的影响;QRT-PCR分析OSS₁28167对HBV 3.5-kb RNA水平的影响;ELISA检测OSS₁28167对HBs Ag和HBe Ag分泌水平的影响;Western blot检测OSS₁28167对HBs蛋白质水平的影响。3.在HBV转基因小鼠中,通过腹腔注射50mg/kg浓度的OSS₁28167溶液,光比色法分析小鼠血清中ALT的水平;Real-time PCR检测小鼠血清中HBV DNA的水平;ELISA检测小鼠血清中HBs Ag和HBe Ag的水平。此外,Real-time PCR分析小鼠组织中HBV DNA水平;QRT-PCR分析小鼠组织中total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平;IHC检测小鼠组织中HBc蛋白质水平。4.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中转染sh SIRT6质粒,real-time PCR和southern blot检测SIRT6沉默对HBV core DNA水平的影响;QRT-PCR分析SIRT6沉默对total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平的影响;IFC和western blot分别检测SIRT6沉默对HBc和HBs蛋白质水平的影响;ELISA分析SIRT6沉默对HBs Ag和HBe Ag分泌水平的影响;Taqman probe specific real-time PCR分析 SIRT6沉默对HBV ccc DNA水平的影响。5.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中转染Flag-SIRT6质粒,同时用100μM OSS₁28167处理细胞,western blot分析OSS₁28167对SIRT6蛋白质水平及其去乙酰化酶活性的影响;Real-time PCR和southern blot检测HBV core DNA水平;QRT-PCR检测total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平;Taqman probe specific real-time PCR检测HBV ccc DNA水平,分析OSS₁28167是否拮抗SIRT6过表达对HBV复制和转录的调控作用。6.在Huh7细胞中共转染HBV启动子和Flag-SIRT6质粒,双荧光素酶报告系统分析过表达SIRT6对HBV启动子活性的影响。7.在Hep G2.2.15细胞中转染Flag-SIRT6质粒,q RT-PCR筛查SIRT6对HBV Cp活性相关的转录因子m RNA水平的影响,western blot进一步分析SIRT6对PPARα蛋白质水平的影响。8.在Hep G2.2.15细胞中转染sh SIRT6质粒,q RT-PCR和western blot分别检测沉默SIRT6对PPARαm RNA和蛋白质水平的影响。9.用100μM OSS₁28167处理Hep G2.2.15细胞,q RT-PCR和western blot分别检测OSS₁28167对PPARαm RNA和蛋白质水平的影响。10.在Huh7细胞中共转染p GL3-Cp和sh PPARα质粒,双荧光素酶报告系统验证沉默PPARα对HBV Cp活性的影响。11.在Hep G2.2.15细胞中转染sh PPARα质粒,real-time PCR和q RT-PCR分别检测沉默PPARα对HBV core DNA和3.5-kb RNA水平的影响;ELISA分析沉默PPARα对HBs Ag和HBe Ag分泌水平的影响;Western blot分析沉默PPARα对HBs蛋白质水平的影响。12.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中共转染Flag-SIRT6和sh PPARα质粒,real-time PCR和southern blot检测HBV core DNA水平,q RT-PCR检测HBV 3.5-kb RNA水平,分析PPARα在SIRT6调控HBV复制和转录过程中的作用。13.Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞用100μM OSS₁28167处理,同时转染Flag-SIRT6或Flag-PPARα质粒,real-time PCR和southern blot检测HBV core DNA水平,q RT-PCR检测HBV3.5-kb RNA水平,分析SIRT6和PPARα是否参与了OSS₁28167对HBV复制和转录过程的抑制作用。结果:1.在小于400μM浓度范围内,OSS₁28167对Hep G2.2.15和Hep G2-NTCP细胞无明显毒性作用。2.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,OSS₁28167显著降低HBV core DNA水平、HBV 3.5-kb RNA水平、HBs Ag和HBe Ag分泌水平以及HBs蛋白质水平（P<0.05）。3.OSS₁28167以50mg/kg浓度给药对小鼠血清中ALT的水平无明显影响;OSS₁28167呈时间依赖性降低小鼠血清中HBV DNA、HBs Ag和HBe Ag水平（P<0.05）;OSS₁28167给药组小鼠肝组织中HBV DNA水平、total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平以及HBc蛋白质水平显著低于阴性对照组（P<0.05）。4.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,SIRT6沉默显著降低HBV core DNA水平、total HBV RNAs和3.5-kb RNA水平、HBc和HBs蛋白质水平、HBs Ag和HBe Ag分泌水平（P<0.05）,然而SIRT6沉默不影响Hep G2-NTCP细胞中HBV ccc DNA的水平。5.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,OSS₁28167明显抑制SIRT6的去乙酰化酶活性（P<0.05）,而对SIRT6蛋白质水平无明显影响;此外,OSS₁28167显著减弱了SIRT6对HBV转录和复制的促进作用。6.SIRT6过表达明显增强HBV Cp活性（P<0.05）,而对HBV其它三个启动子活性无明显影响。7.在Hep G2.2.15细胞中,过表达SIRT6显著上调转录因子PPARα的m RNA和蛋白质水平（P<0.05）。8.在Hep G2.2.15细胞中,沉默SIRT6则显著下调PPARα的m RNA和蛋白质水平（P<0.05）。9.在Hep G2.2.15细胞中,OSS₁28167明显降低PPARα的m RNA和蛋白质水平（P<0.05）。10.PPARα沉默明显降低HBV Cp的活性（P<0.05）。11.在Hep G2.2.15细胞中,PPARα沉默明显抑制HBV的转录和复制。12.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,PPARα沉默后,SIRT6促HBV转录和复制的作用明显减弱。13.在Hep G2.2.15细胞和已感染HBV的Hep G2-NTCP细胞中,过表达SIRT6或PPARα减弱了OSS₁28167对HBV转录和复制的抑制作用。结论:在本文中,我们首先分析了SIRT6抑制剂OSS₁28167对HBV复制的影响,结果表明,OSS₁28167可抑制HBV稳定表达细胞系和HBV自然感染模型中HBV的复制;此外,OSS₁28167在HBV转基因小鼠中也具有有效的抗病毒作用;进一步,我们发现OSS₁28167可通过抑制SIRT6的去乙酰化酶活性下调PPARα的表达,降低HBV Cp的转录活性,最终抑制HBV的转录和复制。综上所述,OSS₁28167可能是一种潜在的抗HBV药物。