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随着组织工程骨研究的深入，用于较小骨缺损治疗的颗粒工程骨技术已基本达到临床治疗要求；但针对大段骨缺损治疗的工程骨技术，与临床应用尚有较大距离。从仿生学角度重建工程骨的神经支配及血液供应，将有望克服目前工程骨骨修复效果欠佳，力学性能较差等缺陷；既往研究发现神经组织存在于骨组织中且参与骨代谢的调节，动物实验也表明当骨支配神经遭到破坏后，支配区域骨组织密度明显下降，生物力学性能也严重受损[1]，故此我们认为骨神经化可能是改善组织工程骨修复效果的关键问题。雪旺细胞作为外周神经髓鞘细胞，广泛应用于中枢、周围神经损伤的重建研究，其通过机械性引导，分泌神经生长因子(NGF)、促突起生长因子(NPF)、轴突诱导因子，促进髓鞘化等方式引导神经轴突再生[2-3]，故此本实验以雪旺神经细胞培养、支架材料鉴定、细胞材料复合培养为主要研究内容，首次探索雪旺细胞在三维骨支架上的生物学特性，为骨神经化的研究开辟道路。我们选择在神经再生研究中应用广泛的大鼠雪旺氏细胞（Schwann’s cells：SCs），临床常用的人同种异体骨作为实验对象；从大鼠雪旺细胞（SCs）原代培养方法改进，人同种异体骨支架的制备观察、毒性检测，及SCs在三维骨支架上的生长特性三个方向设计实验；目的为改进原代SCs培养技术，参照二维培养模式，观察三维培养模式下骨支架空隙结构、材料理化特性等对SCs生长状况的影响。一、雪旺细胞（SCs）原代培养方法的改进及验证既往文献报道SCs培养主要障碍是：细胞增殖慢、易凋亡、生长周期短，易被成纤维细胞污染；针对以上问题我们从培养基成分、取材及培养步骤、纯化方法等方面进行了技术创新，以提高SCs增殖速度及纯度；方法：配置新型培养液，综合应用谷氨酰胺（Gsn）、牛垂体提取物（BPE）、腺苷酸环化酶激活物（forskolin）等雪旺促生长因子；取P2代细胞，实验组用新型培养液，对照组采用普通培养液培养1-8天，行细胞形态学观察、MTT法细胞增殖检测；取P0代采用多次、双向差速法，阿糖胞苷分段抑制法等改进纯化方法，对SCs进行处理，传至P1代行S-100+DAPI免疫荧光染色，激光共聚焦检测，分析图片计算纯度，与既往经典培养方法文献报道结果对比。结果：相差、共聚焦显微镜结果显示SCs形态良好、增殖正常；细胞增殖检测：第1-3d两组细胞光吸收值比较，差异无统计学意义（P>0.05），第4-8d实验组光吸收值高于对照组，经统计学分析差异有统计学意义（P<0.05)；P1代SCs纯度为95.89±3.45%，高于既往文献95%的纯度报道，且纯度随代数的增加而提高。结论：新型促增殖培养液可促进SCs增值，纯化方法提高了SCs纯度，新培养方法可为骨神经化的研究提供优质的SCs细胞。二、异种骨支架材料的制备与检测目的：制备异种骨支架材料即人同种异体骨，支架材料形态学观察，检测材料孔径、孔隙率及细胞毒性；方法：支架材料制备、储存由西京医院综合骨库完成；体式解剖显微镜支架形态学检测；液体替代法检测材料孔隙率；扫描电镜图片检测分析材料孔径范围；提取材料浸提液细胞毒性检测，实验组：细胞培养液添加材料浸提液，对照组：不添加浸提液，细胞计数法检测两组细胞增值规律；结果：材料孔隙率（porisity）为78.26±2.95%，孔径：300-1000μm，支架材料具有良好的三维孔隙结构；两组细胞生长曲线趋势一致，绝大多数时间点细胞数量差异无统计学意义（P>0.05）结论：材料成分对细胞增殖无明显毒性反应，人同种异体骨支架的空间结构、理化性能有利于骨神经化的进行。三、二维平面、三维立体雪旺细胞（SCs）培养模型的建立与研究目的：研究三维立体结构对SCs增殖的影响，验证骨支架材料与SCs的生物相容性，总结神经细胞与骨支架复合培养的规律。方法：制备鼠尾胶原；实验分组：三维培养实验组（SCs+骨支架材料），二维培养对照组（SCs+胶原玻片）；细胞增殖检测：培养1-8d，计数法检测两组细胞增殖规律并绘制生长曲线；SEM检测：复合培养后3d、7d两组取样扫描电镜检测。结果：两组细胞生长曲线整体变化趋势相近，主要时间点细胞数差异经统计学分析，无统计学意义(P>0.05)；SEM检测：两组细胞均可正常粘附生长，无明显细胞固缩或崩解现象，细胞梭形形态、串珠及肩并肩特征性排布方式，较之前相差显微镜、免疫荧光检测结果未见明显改变，图片分析可见第3d，实验组细胞胞体长度（50-100μm）明显长于对照组（40-50μm），第7d，两组细胞长度相似（50-100μm），实验组细胞表现出明显孔内迁移趋势。结论：支架材料与SCs的生物相容性和鼠尾胶原相仿，均良好；二维、三维状态下细胞增殖速率无明显差异；SCs可在骨支架上正常粘附生长、增殖迁移。小结：本实验采用改良方法培养原代大鼠SCs，从形态学、细胞增殖两方面对二维平面、三维骨支架不同培养状态下的SCs进行检测观察，评估支架材料及SCs生物学特性；实验结果显示：新方法SCs增殖活跃，纯度优异；SCs与人同种异体骨支架具有良好的生物相容性；三维骨支架对SCs粘附增殖无明显不良影响。