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作为胞内活性一碳单位(C1)的主要来源，L-丝氨酸对维持菌体生理代谢具有不可替代的作用，导致其难于实现以糖质为原料的直接发酵法生产。目前，L-丝氨酸生产菌的选育方法主要是菌株的传统诱变和筛选。然而，传统诱变会积累次级突变，导致菌种生长缓慢；并且存在筛选盲目性大、低环境耐受力、生成副产物和菌种易退化等缺点。随着基因工程技术的发展和基因组测序工作的完成，定向、系统代谢工程改造更多地应用于L-丝氨酸工程菌的构建。我们在已有的L-丝氨酸代谢工程研究的基础上，通过引入不同的基因改造靶点，研究这些靶点对L-丝氨酸积累、菌株生长和代谢流重分配的影响。
本研究根据谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032胞内L-丝氨酸的代谢途径，采用阻断或减弱L-丝氨酸分解代谢，解除关键酶的反馈抑制作用，增加合成前体，增强合成途径的载流量的综合策略，对L-丝氨酸途径进行了系统的代谢工程改造，构建了基因工程菌谷氨酸棒杆菌SER-8(WT-△sdaA△glyRserAr-pXMJ19-serAr-pgk)。连续补料发酵试验显示菌株SER-8的最大比生长速率为0.26/h，与野生型相比明显减慢，而且L-丝氨酸的积累量在不同的发酵生长时期呈现不同的变化。在对数生长期，胞内L-丝氨酸总量为(14.22±1.41)μmol g/CDM，高于胞内甘氨酸总量；与野生型中这两种氨基酸的分配相反(甘氨酸更高)。通过构建基元模型，分析菌株SER-8与野生型代谢流分配的差异。代谢流分析证明过表达3-磷酸甘油酸激酶(PGK)将更多的碳流从戊糖磷酸途径(PPP)导向糖酵解途径(EMP)，导致TCA循环代谢流分配比率增加了27％；而过表达脱敏的3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDHr)使L-丝氨酸合成流量增加了两倍。敲除激活蛋白GlyR部分减弱了L-丝氨酸向甘氨酸的分解，代谢流比率仍有38.2%。实验结果表明胞内L-丝氨酸的代谢对维持谷氨酸棒杆菌的生长至关重要，而通过引入甘氨酸裂解系统(GCV)，分解过量的甘氨酸，同时增加胞内C1的供应将是未来L-丝氨酸代谢工程改造的新靶点。另外，为了避免启动子PglyA更换为启动子Ptac渗漏表达造成的基因自发回复突变和性状退化，采用谷氨酸棒杆菌弱启动子Phom替换必需基因glyA自身强启动子PglyA，可以平衡菌株生长对C1的需求。而且，在启动子Phom的调控下，丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)表达减弱，但菌株的生长和代谢未受到明显的影响，而L-丝氨酸的积累明显加强。为进一步增强L-丝氨酸合成通路的流量，按照ser C-ser B-serAr的连接顺序构建过表达载体pWYE1130。将该表达载体转入菌株SER-16(WT-△sdaA△glyR△cysE serAr-PglyA：：Phom)，构建了工程菌SER-19(WT-△sdaA△glyR△cysE serAr-PgtyA：：Phom-pXMJ19-serCB-P45-serAr)。菌株SER-19发酵46 h后，发酵液中L-丝氨酸的积累量达到最高，为43.34 mmol/L(约4.55 g/L)。此外，L-丝氨酸作为发酵终产物，在发酵末期，只有少量分解，菌株性状和生产能力均稳定。