乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是公认安全(generally regard as safe,GRAS)的食品级微生物,表达的外源蛋白无需纯化就可直接连同菌体一起服用,因此利用L.lactis表达各种抗原并将它们作为口服疫苗的研究日益受到人们的关注。本文利用NICE(nisin-controllcd gone expression)系统在L.lactis中分泌表达乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)决定簇PreS和PreSa蛋白及人alpha2b干扰素(human interferonα-2b,IFN),旨在研究开发一种方便、安全、有效的新型乙肝口服疫苗。　　 HBV的感染可导致急慢性肝炎和肝癌,严重危害人类健康。HBsAg是产生保护性抗体的重要抗原,其PreS和PreSa抗原决定簇在刺激机体产生免疫方面有重要作用。本文构建了乳酸菌表达载体pNZ-pres和pNZ-presa,并使用L.lactisUsp45蛋白的信号肽SPUsp45指导Pres和PreSa的分泌表达。Western blot结果显示,经nisin诱导后,PreS和PreSa均得到表达,产物位于胞内。将表达PreS的L.lactis NZS和表达PreSa的L.lactis NZSA分别口服喂饲Balb/c小鼠,在小鼠体内均检测到PreS特异的肠道Iga和血清IgG抗体,表明重组乳酸菌能刺激小鼠产生黏膜免疫和体液免疫反应。　　 为提高L.lactis NZS和L.lactis NZSA的免疫反应强度,我们同时将表达IFN的乳酸菌作为免疫佐剂。根据乳酸菌偏爱密码子,人工合成密码子优化的人干扰素基因ifnm,并构建分泌载体pNZ-ifnm。SDS-PAGE和Western blot结果均证明ifnm在乳酸菌L.lactis NZI中得到表达,且有部分IFN蛋白分泌至胞外。同时喂饲L.lactis NZI和L.lactis NZS或L.lactis NZSA的两组免疫小鼠产生的血清IgG强度是没有口服L.lactis NZI小鼠的两倍,说明IFN成功发挥了黏膜佐剂效应。但其对肠道IgA抗体的提高并不显著。　　 为提高IFN的佐剂能力,我们使用下列策略试图提高IFN分泌量。(1)在IFN的N端融合带负电荷的9氨基酸小肽LEISSTCDA(LEISS),IFN分泌效率从5％提高到12％,表达量也提高到原来的1.5倍。(2)将SPUsp45更换为短乳杆菌S蛋白的信号肽SPSlpA,IFN分泌效率提高到60％,但总产量却有所降低.重组乳酸菌产生的IFN经检测均具有抗病毒活性。因此,融合LEISS能提高IFN的分泌和表达量,且SPUsp45的分泌能力优于SPSlpA。　　 综上所述,表达PreS和PreSa的乳酸菌可在免疫小鼠体内成功引起黏膜免疫和体液免疫反应,且表达IFN的乳酸菌可作为黏膜佐剂。本文构建的重组乳酸菌有作为乙肝口服疫苗的潜力。　　 另外,本实验室的前期工作发现nisin抗性蛋白NSR的表达可影响NICE系统的诱导效率。本文比较了完整的nisin分子和其被NSR降解片段(nisin1-28和nisin29-34)的诱导能力,发现降解片段的诱导能力大大降低。因此,nsr不宜与NICE系统同时使用。