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研究目的恶性肿瘤的发生与DNA损伤应答系统的缺失紧密相关,深入研究DNA损伤应答分子机制便于了解肿瘤的发病机理,并为肿瘤的治疗和化疗新药的开发提供可靠的理论基础。DNA损伤应答系统中,CHK2作为损伤信号传递的重要介导子,是DNA损伤修复的关键因子,研究报道CHK2的泛素化和磷酸化修饰参与调控DNA损伤反应机制,但目前关于CHK2的去泛素化研究还不清楚。本研究着重探讨CHK2的去泛素化修饰在相关肿瘤发生及对耐药性所发挥的作用。研究方法1.利用GeneCards数据库筛选出可能与CHK2互作的去泛素化酶,分别转染以上质粒至HEK-293T细胞48小时后,收集细胞进行免疫共沉淀(Co-IP)实验,Western Blot检测能与CHK2互作的去泛素化酶。2.利用慢病毒载体shRNA分别构建USP39shRNA和CHK2shRNA稳定干扰株,Western Blot检测下调USP39基因后CHK2蛋白水平的变化。3.分别转染USP39和CHK2至HEK-293T细胞,进行半内源免疫共沉淀反应,Western Blot检测CHK2与USP39的互作;利用原核表达菌株BL21表达并纯化出野生型GST-USP39-WT融合蛋白与转染Flag-CHK2的HEK-293T细胞裂解液进行体外孵育反应,Western Blot检测蛋白的相互。4.构建USP39及其截断体的原核表达载体,利用原核表达菌株BL21表达并纯化出全长GST-USP39-FL及其截断体GST-USP39-1(1-219aa)和GST-USP39-2(220-569aa)融合蛋白,分别与转染Flag-CHK2的HEK-293T细胞裂解液进行体外孵育反应,Western Blot检测CHK2与USP39互作区域。5.分别转染Myc-USP39和Flag-CHK2至HEPG2肝癌细胞,利用免疫荧光实验分别检测USP39和CHK2亚细胞定位。6.在USP39shRNA稳定细胞株中分别回补USP39、使用蛋白酶体抑制剂MG132及放线菌酮CHX进行处理,Western Blot检测CHK2与USP39的蛋白水平变化。7.利用点突变试剂盒构建出酶催化失活的突变体(USP39第306个氨基酸位点的突变体,USP39C306A),原核表达菌株BL21表达并纯化出GST-USP39-CA,把野生型的GST-USP39-WT与点突变的GST-USP39-CA分别与转染Flag-CHK2和His-Ub的HEK-293T细胞裂解液进行体外孵育反应,WesternBlot检测CHK2的多聚泛素化水平;把His-ub过表达质粒分别与USP39-CA和USP39-WT过表达质粒同时转染至HEK-293T细胞,Western Blot检测CHK2的多聚泛素化水平。8.利用软琼脂实验,流式细胞术检测下调USP39,CHK2及同时下调USP39与CHK2后肺癌细胞的生长,细胞凋亡及细胞周期阻滞。9.利用免疫组化实验(IHC),检测USP39和CHK2在肺癌组织中的表达。研究结果1.半内源免疫共沉淀实验表明USP39与CHK2发生相互作用,GST Pull-down实验进一步表明CHK2与USP39直接互作,同时免疫荧光实验表明USP39与CHK2共同定位于细胞核内。2.利用慢病毒载体shRNA介导下调USP39后显著降低CHK2的蛋白水平及增加CHK2的多聚泛素化水平。3.在shRNA介导USP39下调的稳定细胞株中回补USP39及经MG132处理后CHK2的蛋白水平得到恢复,同时经CHX处理后的实验结果表明USP39调控CHK2蛋白稳定性。4.体内和外去泛素化实验结果表明野生型的USP39可以去泛素化CHK2,酶催化失活型的USP39CA失去去泛素化CHK2的能力。5.软琼脂实验、流式细胞术实验结果表明,下调USP39,CHK2及同时下调USP39与CHK2后促进肺癌细胞的生长、抑制细胞凋亡及减弱细胞周期的阻滞。6.免疫组化实验结果表明CHK2与USP39在肺癌组织中都呈现低表达,并存在较强的相关性,同时CHK2与USP39在肺癌中高表达可以提高患者的生存率。研究结论1.USP39去泛素化稳定CHK2蛋白水平,促进肺癌细胞凋亡,促进细胞生长。2.CHK2和USP39在肺癌组织中低表达,并且CHK2与USP39的高表达可以提高肺癌患者的生存率。