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异黄酮Genistein是大豆中的一种次生代谢物,它可通过对动物及人体细胞和分子水平的多种调控机制,预防疾病发生,发挥健康效应。通过寻找植物异黄酮合成途径中的关键酶基因,采用遗传转化的手段,增加非豆科植物中Genistein含量,可提供更广泛的异黄酮来源,促进人体健康。本研究在整体动物和体外细胞模型中,较为系统地研究了 Genistein脑缺血保护相关的药理学活性,并阐明其保护作用的相关机理;通过调控异黄酮代谢途径中的关键酶基因,以非豆科植物烟草作为生物反应器,在烟草中表达影响Genistein合成的基因并观察其积累。主要研究结果有以下几点:1.通过建立小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)及再灌注模型,评价Genistein的抗脑缺血保护活性。Genistein(2.5,5,10 mg/kg)连续灌胃给予14 d可明显降低脑缺血再灌注小鼠的脑梗塞率,提高神经行为学评分,减少神经细胞凋亡率。Genistein预处理可抑制缺血脑组织及线粒体中活性氧(ROS)的生成,增加超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性,并降低丙二醛(MDA)含量,体现出良好的抗氧化作用。Genistein可改善缺血后的线粒体功能障碍,表现为阻止细胞色素C由线粒体释放到细胞质,并抑制凋亡执行蛋白caspase-3的活化。此外,Genistein可有效阻断在缺血条件下ROS诱导的核因子-κB(NF-κB).信号转导通路激活:通过下调NF-κB/p65的表达和磷酸化、阻止抑制蛋白KBa(IκBa)的降解及磷酸化,对整个信号通路起抑制作用。以上结果表明,Genistein对于局灶性脑缺血小鼠的保护作用可能与直接和间接的抗细胞氧化、改善线粒体功能以及抑制NF-κB信号通路激活相关。2.在外源性过氧化氢(H202)诱导的神经元损伤模型中,通过形态学观察、免疫细胞化学鉴定和western blot检测,我们发现Genistein(0.01-1 μM)预处理24 h可有效抵抗500M H202介导的细胞存活率下降和ROS的过量积累。Genistein可显著抑制神经元凋亡,逆转凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的比值,抑制caspase-9和caspase-3的活性。在体外实验中,我们同样观察到Genistein可下调NF-κB/p65的表达,并抑制p65和IκBa磷酸化。此外,Genistein还能抑制氧化应激状态下促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的激活,包括c-Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号相关激酶(ERK)。这些结果表明,Genistein可通过减少细胞内ROS生成、调节凋亡相关蛋白和抑制ROS诱导的NF-κB及MAPK信号通路激活,有效地对抗氧化应激损伤,发挥神经保护作用。3.以两种大豆材料北丰17(Beifeng17)和ZYD4368作为实验材料,克隆了大豆异黄酮合酶IFS1和IFS2两种亚型的cDNA序列。构建pMDC83-Beifeng17IFS1、pMDC83-ZYD4368IFS1、pMDC83-Beifeng17IFS2 和 pMDC83-ZYD4368IFS2 四种过表达载体,采用农杆菌侵染的方法,遗传转化模式植物烟草。经PCR鉴定,共获得转基因植株128株,总阳性率达87.1%。采用实时荧光定量PCR检测转基因烟草中目的基因的表达情况及拷贝数。结果显示,叶片中IFS1基因表达量在6-50之间,含1-9个拷贝数;IFS2基因表达量为2-25,含1-7个拷贝数。转基因烟草花瓣中两种基因的表达与叶片中相比无显著差异。采用高效液相色谱(HPLC)方法检测转基因植株中Genistein含量。在所有检测花瓣样品中均观察到Genistein积累,其中转IFS1植株Genistein 含量为 5.41-6.28 μg/g 鲜重,转 IFS2 植株 Genistein 含量达 19.65-23.7 μg/g 鲜重。在叶片中,共检测到6株转基因烟草含Genistein。其中转Beifeng17IFS2 2株(3.06μg/g鲜重和6.27μg/g鲜重),转ZYD4368IFS2 4株(3.31-18.78μg/g鲜重),而在两种转IFS1烟草叶片中未检测到Genistein积累。在营养生长期间,野生型和转基因烟草的表型无明显差别。但在生殖生长时期,我们观察到多株转基因植株花色变淡的现象。以上结果表明,IFS2基因在Genistein合成途径中发挥更为关键的作用,转基因烟草花中Genistein含量及表达的稳定性显著高于叶片。进一步对影响Genistein合成的关键遗传因素进行调控,增加其含量,作为可能的植物生物反应器应用于实际生产中。综上所述,大豆异黄酮Genistein具有良好的脑保护活性和抗氧化作用,可用于食品添加策略预防急性神经性疾病的发生;通过向模式植物烟草中引入Genistein合成的关键酶基因IFS,以烟草作为生物反应器产生Genistein,可能成为增加生物活性物质来源和产量的有效方法。