中药注射剂是我国独创的新剂型,已广泛应用于危重疾病的急救及感染性、心脑血管和恶性肿瘤等疾病的治疗,存在着巨大的市场需求。随着中药注射剂临床应用的广泛,其不良反应频频发生,尤其可能造成过敏性休克和死亡等严重后果,引起社会各界广泛关注。由于中药注射剂成分复杂,各种物质含量较低,传统的致敏原检测方法对其致敏性检测具有一定的局限性,因此,建立新的更加敏感的检测模型是突破中药注射剂安全性评价的瓶颈之一。在本研究中,采用大鼠嗜碱性白血病细胞(rat basophilic leukemia, RBL)的亚系RBL-2H3作为试验模型,利用二硝基苯基牛血清白蛋白结合物(Dinitrophenylated bovine serum albumin, DNP-BSA)和卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)作为致敏原,对建立体外致敏性检测模型的可行性进行了探讨。通过对RBL-2H3细胞活化脱颗粒缓冲溶液条件、生物标志物、检测时间、致敏血清制备、致敏动力学等方面进行研究,探讨影响RBL-2H3细胞模型检测灵敏度的因素,建立完善的致敏原体外检测模型,并用此模型进行葛根素和清开灵注射液的致敏性进行检测,为中药注射剂临床前过敏反应评价提供新的方法。1.RBL-2H3细胞检测模型的优化1.1利用DNP-BSA对RBL-2H3细胞模型进行优化目的：通过对影响细胞模型的条件进行优化,建立灵敏的DNP-BSA细胞检测模型。方法：选择细胞试验合适的缓冲溶液、生物标志物,建立灵敏的检测方法；探讨抗原、抗体浓度对细胞脱颗粒影响,找到抗原、抗体浓度对试验的影响规律,建立灵敏的DNP-BSA致敏性体外检测模型,并与大鼠被动皮肤过敏(Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA)实验的检测灵敏度进行比较。结果：研究发现,DMEM细胞培养基是细胞试验最佳缓冲溶液,β-己糖胺酶作为生物标志物与组胺、LTC4相比具有较高的灵敏度。抗体浓度对细胞脱颗粒的影响曲线是“钟”形图,抗原浓度曲线是对数曲线。细胞模型检测抗二硝基苯基单克隆抗体(anti-dinitrophenolmonoclonal IgE antibody, anti-DNP IgE)的灵敏度要高于大鼠PCA模型。结论：优化后的RBL-2H3细胞模型的检测灵敏度高于大鼠PCA试验模型,提示该模型适用于成分含量较低的中药注射剂致敏性检测。1.2利用OVA对RBL-2H3细胞模型进行优化目的：通过对影响致敏血清制备、细胞被动致敏过程的条件进行优化,建立灵敏的OVA细胞检测模型。方法：选用高IgE表达的BN大鼠作为致敏动物,采用1,3,5,7,9天隔日致敏大鼠的方案进行血清制备,对取血时间、致敏动力学(sensitization kinetics)和致敏血清类型(佐剂组和非佐剂组)对细胞检测灵敏度的影响进行探讨,建立完善的OVA致敏性体外检测模型,并与大鼠PCA试验的检测灵敏度进行比较。结果：研究发现,当OVA与佐剂共同致敏BN大鼠时,致敏21天血清中的抗体水平最高,此时收集血清进行试验检测灵敏度最高。血清与细胞孵育时间越长,细胞致敏程度越高,对抗原反应越强。结论：细胞模型检测OVA抗血清的灵敏度要高于大鼠PCA模型,提示该模型可以用于微量蛋白质的检测。2.RBL-2H3细胞检测模型检测准确性的验证目的：利用弱致敏原牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)对RBL-2H3检测模型的准确性进行验证。方法：根据DNP-BSA和OVA试验对细胞模型的改进方法,利用改进的RBL-2H3细胞模型对BSA的致敏性进行检测,并将结果与大鼠PCA试验进行比较,探讨细胞模型的准确性。结果：BN和Wistar大鼠PCA试验所能检测到的最高抗体滴度为32,RBL-2H3细胞所能检测到的最高抗体滴度为128。结论：RBL-2H3细胞模型具有较好的准确性,可用于药物致敏性检测。3.RBL-2H3细胞模型检测葛根素和清开灵注射液的致敏性并进行机制探讨目的：检测葛根素和清开灵注射液的致敏性并探讨其过敏反应发生机制。方法：利用建立的RBL-2H3细胞模型检测葛根素和清开灵注射液的致敏性,并将试验结果与BN大鼠PCA试验进行比较。通过对两种注射液致敏大鼠血细胞变化和大鼠血清中的抗体类型进行检测,探讨过敏反应的发生类型。结果：葛根素和清开灵注射液应用本试验模型进行检测提示具有一定的致敏性。RBL-2H3细胞模型的检测灵敏度高于大鼠PCA试验。两者致敏大鼠血液中的白细胞均增多,葛根素注射液致敏大鼠血液中血红蛋白数量有所下降。两者致敏大鼠血清中均有特异性IgE、IgG存在,并且血清总IgE、IgG的含量要高于正常大鼠和OVA致敏大鼠。结论：RBL-2H3细胞体外模型可用于作为葛根素和清开灵注射液致敏性检测模型。从血液变化及抗体类型来看,两者都具有引发Ⅰ型过敏反应的潜能。