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鸡球虫病是危害家禽业的一种重要寄生虫病，该病可引起腹泻，增重减少，饲料利用率与转化率降低，甚至死亡，给养禽业带了巨大的经济损失。布氏艾美耳球虫是一种引起幼龄家禽出血性小肠球虫病的艾美耳球虫，病变部位仅限于小肠，导致血性腹泻，较低的饲料转化率，消瘦，严重的情况下死亡。到目前为止，只有少数几种布氏艾美耳球虫的蛋白已被证实并评价了它们的免疫原性，研究新的抗原并评价对布氏艾美耳球虫的保护性，为新型疫苗的构建奠定基础。 本研究中，利用单卵囊技术分离出布氏艾美耳球虫，提取孢子化卵囊的RNA，反转录扩增出cDNA。使用Oligo Primer Premier5.0软件，根据已公布的布氏艾美耳球虫MIC2和AMA1序列（GenBank登录号为AB723700和AB723701），分别设计出布氏艾美耳球虫微线蛋白2(EbMIC2)和布氏艾美耳球虫顶膜抗原1（EbAMA1）基因的特异性引物。PCR扩增并回收、纯化876bp的EbMIC2和1656bp的EbAMA1特定片段，然后连接至pMD19-T克隆载体中，重组质粒经PCR鉴定，限制性内切酶分析和测序。序列分析表明，EbMIC2基因的ORF长为876bp，编码291个氨基酸，理论分子量32kDa;EbAMA1基因的ORF长为1656bp，编码551个氨基酸的蛋白质，理论分子量60kDa。EbMIC2与GenBank公布的核苷酸和氨基酸相似性分别为99.43和98.63％，EbAMA1与GenBank公布的核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.52％和98.55％。 EbMIC2和EbAMA1分别经限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切插入到原核表达载体pET-28a(+)中，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。重组质粒在大肠杆菌中被0.8mM IPTG诱导进行表达，表达产物进行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate)和Western印迹分析。结果表明，表达的重组蛋白EbMIC2能被自然感染鸡血清所识别。用EbMIC2重组蛋白多克隆抗血清与子孢子全虫可溶性抗原进行免疫印迹，证明EbMIC2天然蛋白约为36kDa。重组蛋白EbAMA1也能被自然感染鸡血清所识别。用EbAMA1重组蛋白多克隆抗血清与子孢子全虫可溶性抗原进行免疫印迹，证明EbAMA1天然蛋白约为64kDa。 EbMIC2和EbAMA1的ORF分别插入真核表达载体pVAX1，用于构建重组质粒pVAX1-EbMIC2和pVAX1-EbAMA1。通过RT-PCR（反转录聚合酶链式反应）和Western印迹法检测鸡体内目的基因的表达结果。免疫保护试验鸡免疫两次，分别在14和21日龄进行肌肉注射免疫，每羽免疫100μg重组质粒（浓度1μg/μl），攻虫非免疫组（红对照组）在相同的免疫部位注射相同剂量的无菌TE缓冲液，同时设立pVAX1空载体对照组和不免疫不攻虫对照组。第二次免疫后一周，每组随机选取10只鸡心脏采血，分离血清用于测定细胞因子和抗体的水平。除不免疫不攻虫对照组外，其余各组试验鸡鸡分别经口接种1×105个孢子化的布氏艾美耳球虫卵囊。攻虫七天后，所有鸡只进行称重、屠宰并收集回肠。综合卵囊减少率，病变计分，抗球虫指数(ACI)和体重增加来分析评价免疫接种的效果。结果表明，重组质粒能够在体内进行高效表达，可减轻肠道病变，减缓体重减轻和减少卵囊产量。重组质粒pVAX1-EbMIC2、pVAX1-EbAMA1抗球虫指数(ACI)分别为179和178，表现出较好的保护作用。EbMIC2、EbAMA1重组蛋白抗球虫指数(ACI)分别为159和160，表现出中等的保护作用。与对照组相比，重组蛋白EbMIC2、EbAMA1和重组质粒pVAX1-EbMIC2，pVAX1-EbAMA1均能诱导高滴度IgG抗体(p＜0.05)。此外，与对照组相比，重组质粒pVAX1-EbMIC2，pVAX1-EbAMA1和重组蛋白EbMIC2，EbAMA1免疫鸡后IFN-γ、IL-10、IL-17、TGF-β均显著升高(p＜0.05)，IL-4变化不明显。这些结果表明，EbMIC2和EbAMA1具有较好的免疫原性，并可能成为开发抗布氏艾美耳球虫疫苗的候选抗原。 此外，还进行了两种蛋白的被动免疫试验。首先，无球虫鸡分别肌肉注射免疫两次重组重组质粒pVAX1-EbMIC2或pVAX1-EbAMA1。最后一次加强免疫后七天，收集血清，用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IgG抗体效价。21日龄无球虫鸡，每只鸡分别静脉(Ⅳ)注射30，50和100微升上述制备的抗血清，攻虫对照组和不攻虫对照组鸡分别注射TE缓冲液。在注射当天，除了不攻虫对照组外，所有鸡只均经口接种1×105孢子化的布氏艾美耳球虫卵囊。攻虫七天后，所有鸡只进行称重、屠宰并收集回肠，综合卵囊减少率，病变计分，抗球虫指数(ACI)和体重增加来分析评价被动免疫接种的效果。结果表明，抗球虫重组质粒pVAX1-EbMIC2和pVAX1-EbAMA1血清能够较为有效保护鸡免受鸡球虫的感染，不同剂量的抗血清表现出不同的保护作用。