糖尿病心肌病是糖尿病患者发生心衰的主要原因之一,19%的心衰患者合并有糖尿病,目前尚无特效的治疗方法。四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成,具有活血通络、清热解毒兼具滋阴之效。中医理论认为,糖尿病心肌病的病机主要是燥热内伤,久病致瘀,心血瘀阻,蕴久成毒,瘀毒互结,心体心用俱损。四妙勇安汤切中糖尿病心肌病瘀毒损心病机,临床经辨证加减后常用于糖尿病心肌病治疗。基础研究证明,心肌底物代谢异常诱发的心肌脂毒性在糖尿病心肌病发生和发展中发挥着重要作用,胰高血糖素是介导心肌脂毒性的关键介质。心肌脂毒性可能是中医瘀毒的生物学基础之一。本课题组前期研究已证明四妙勇安汤能抑制异丙肾上腺素及主动脉弓缩窄术诱导的心衰。然而,有关四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的作用、机制及其效应成分,目前尚不清楚。本研究以胰高血糖素脂毒性通路为靶标,通过体内外实验研究四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的作用机制及物质基础。另外,通过筛选出四妙勇安汤干预以胰高血糖素为核心的脂毒性信号传导的最优效应成分,部分揭示四妙勇安汤干预糖尿病心肌病的物质基础及作用靶点,为抗糖尿病心肌病的创新药物研发提供实验依据。第一部分 文献综述对胰高血糖素在糖尿病心肌病中的研究进展进行系统探索,梳理胰高血糖素与心衰相关疾病的关系及潜在的信号通路,分析了目前研究的不足之处,为实验研究思路构建提供依据。对四妙勇安汤及其主要成分改善代谢综合征的作用机制进行系统归纳,为四妙勇安汤改善糖尿病心肌病作用及其机制研究提供实验基础。第二部分四妙勇安汤防治糖尿病心肌病的作用及机制研究通过链脲佐菌素构建糖尿病模型小鼠,通过测定给药后血糖血脂、口服葡萄糖耐量、血清胰岛素、胰高血糖素水平、胰腺及肝脏病理形态、胰岛α和β细胞分布,阐明四妙勇安汤对糖尿病小鼠糖脂代谢、胰岛素敏感性及高胰高血糖素血症的改善作用。通过超声影像确定在第18周糖尿病心肌病成模,结合心肌组织HE、WGA、Masson、油红O、TUNEL、CD45及透射电镜染色结果表明:四妙勇安汤能改善糖尿病小鼠心功能,抑制心肌细胞肥大、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、心肌细胞脂质积聚、心肌炎细胞浸润及心肌细胞线粒体形态,其中,降脂、抑制心肌细胞凋亡及维持线粒体形态作用明显,说明四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的作用与抑制脂毒性相关。随后通过WB检测心肌组织中胰高血糖素通路相关蛋白表达,发现四妙勇安汤能抑制糖尿病小鼠心肌组织中胰高血糖素（GLC）、胰高血糖素受体（GCGR）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子1α（PGC-1α）及核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）的表达或激活,能促进糖尿病小鼠心肌组织中AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）的激活,提示四妙勇安汤抗糖尿病心肌病作用与调节GLC/AMPK/NF-kB 和 GLC/PPARα/PGC-1α 通路相关。第三部分四妙勇安汤干预心肌脂毒性的效应成分研究250μM棕榈酸（PA）作用于H9C2心肌细胞,建立心肌细胞脂毒性模型。通过分析20个入血原型成分对PA诱导的H9C2心肌细胞活力及凋亡的影响,结果显示绿原酸、新绿原酸、甘草素、异甘草苷、新异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、木犀草素和阿魏酸能够显著抑制PA诱导的心肌细胞活力的降低及凋亡的增加,提示这9个成分是该复方中改善心肌细胞脂毒性的有效成分。其中,绿原酸和阿魏酸作用最强,用于后续研究。第四部分四妙勇安汤效应成分干预心肌脂毒性的作用机制研究流式细胞仪检测Annexin V/PI双染结果证明,绿原酸和阿魏酸可抑制PA诱导的心肌细胞凋亡。油红O染色及RT-PCR检测脂代谢相关基因表达,结果表明:绿原酸和阿魏酸能降低PA诱导的心肌细胞脂质积聚及脂代谢相关基因PPARα,CD36,UCP3的表达。通过激光共聚焦对棕榈酸和葡萄糖吸收分析证明,绿原酸和阿魏酸可抑制PA诱导的心肌细胞底物利用失常。通过Mitotracker线粒体染色及Seahorse线粒体功能分析,证明绿原酸和阿魏酸能改善PA诱导的线粒体分裂及呼吸功能损伤。初步证明绿原酸和阿魏酸抑制心肌细胞脂毒性作用与心肌细胞能量底物代谢调节及线粒体功能改善相关。GCGR抑制剂（Adomeglivant）干预PA刺激的心肌细胞能抑制PA诱导的心肌细胞凋亡,发现PA通过激活GCGR诱导心肌细胞脂毒性。WB检测GLC通路关键蛋白表达,结果显示:绿原酸和阿魏酸能下调PA诱导的心肌细胞中GCGR、PPARα和PGC-1α的表达,增加p-AMPK的激活,说明绿原酸和阿魏酸通过抑制GCGR信号通路改善PA诱导的H9C2心肌细胞凋亡。综上,体内和体外研究结合阐释了四妙勇安汤及其活性成分绿原酸和阿魏酸能通过调节GLC/PPARα和GLC/AMPK通路,从而改善糖尿病心肌糖脂代谢,抑制心肌脂毒性,发挥防治糖尿病心肌病的作用。特色与创新1.理论创新:将活血解毒治法及其经典方——四妙勇安汤用于糖尿病心肌病的干预,丰富并发展了糖尿病心肌病的瘀毒病机理论。2.技术创新:整合了四妙勇安汤给药后入血原型成分库及体外药效筛选,构建四妙勇安汤干预糖尿病心肌脂毒性的效应成分优选方法,为创新药物的发现提供了新策略。3.机制创新:以GLC/AMPK/NF-kB和GLC/PPARα/PGC-1α通路为切入点,通过在体实验与离体实验相结合,首次深入探讨四妙勇安汤及其效应成分绿原酸、阿魏酸对心肌细胞脂代谢的改善作用,为四妙勇安汤的进一步研究及其临床糖尿病心肌病治疗提供可靠的实验依据。