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北沙参为多年生草本植物,具有较高的营养、保健及药用价值。因其为异花授粉植物,野生与栽培群体中存在着丰富的遗传变异,同时由于北沙参药材长期人工栽培,种子种苗提纯、复壮工作滞后,变异退化,严重影响了道地药材的质量稳定。目前北沙参的品种分类研究仍限于形态学、解剖学的方法,有关北沙参在DNA水平上的分类研究尚未见报道。本实验以北沙参为材料,从制定种子质量标准、DNA提取、RAPD的反应体系与PCR扩增条件建立以及运用RAPD技术对北沙参主要栽培品种进行系统聚类分析,并进行品种种类的划分和分子鉴别方面进行了探讨。
1、本实验通过观察种子的外部形态特征,测定不同产地的北沙参种子净度、千粒重、含水量、发芽率,并据此初步制定了北沙参种子的质量分级标准。
2、本实验利用北沙参叶片DNA来进行RAPD分析,共6个样品。采用CTAB法从叶片中直接提取DNA,然后将其溶于TE缓冲液中,利用紫外分光光度计法和琼脂糖凝胶电泳法检测提取样品基因组DNA的浓度和纯度。结果表明:所提取的北沙参叶片基因组DNA浓度和纯度都很高,无论在质量上还是完整性上都符合RAPD分析的需要。
3、本实验研究了RAPD的影响因素,从而确立了一套优化的北沙参RAPD反应体系和PCR扩增条件,即模板DNA32ng/μl,随机引物1.0μmol/L,dNTPs0.25mmol/L,Mg2+2.5mmol/L,Taq聚合酶1U。其热力学参数为:94℃预变性3min,之后进行40个循环(94℃变性30s,36℃退火60s,72℃延伸90s),最后72℃延伸5min,最后4℃终止反应。
4、从40条10bp随机引物中筛选出了5条具有多态性且重复性好的引物,对山东莱阳北沙参6个样品进行RAPD标记研究,共扩增出95个条带,其中多态性条带90个,占总扩增条带数的94.74%,每个引物可扩增出13~23条多态性带,平均18条。结果表明,供试样品被聚为两类,这与形态学上的分类(据叶柄颜色分类)有一定程度的相似性。