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目的(1)研究盐酸小檗碱对慢性束缚应激IBS-D模型大鼠的药理作用,并研究其作用机制;(2)研究盐酸小檗碱对IBS-D大鼠离体结肠纵向肌收缩张力的影响,研究其对神经传导的调控作用机制。方法建立慢性束缚应激诱导IBS-D大鼠模型,分动物药理学实验和动物组织离体实验两个部分:(1)盐酸小檗碱对IBS-D大鼠的药效评价及其作用机制研究:采用慢性束缚应激诱导建立IBS-D大鼠模型。60只大鼠随机分为对照组10只、模型组50只;对照组不做处理,模型组建立束缚应激诱导模型,每天2h,持续14天。将完成建模的50只老鼠随机分成模型组、阳性组(匹维溴铵组)、盐酸小檗碱低、中、高剂量组,并对其灌胃给药,对照组与模型组灌胃生理盐水,每天1次,连续14天。D0,D7,D14,D21,D28天分别测定各组大鼠的腹部回缩反射评分以评价敏感性,收集并统计排便面积。D28天后处死老鼠取材,qPCR 测定结肠 5-HT3AR、nNOS、Myosin Va、LC8、SLC17A9 mRNA的含量及蛋白的表达。(2)盐酸小檗碱对IBS-D大鼠离体结肠平滑肌神经传导的调控作用:在离体大鼠结肠纵向平滑肌上,我们研究了盐酸小檗碱对平滑肌自发性收缩、胆碱能、氮能、嘌呤能的作用。所用结肠平滑肌样本来自于前述IBS-D大鼠。CO2窒息法处死SD大鼠后,截取1cm结肠肠断置于充有37℃ Kreb’s溶液的八腔灌流系统器官水浴槽内,并高挂在连接有传感器的固定装置上,持续通入混合气(95%C02+5%02),进行平滑肌张力实验。用LabChart软件记录盐酸小檗碱累积浓度(1.625、3.125、1.625、3.125、25、50、100和200μmol/L)对大鼠结肠纵行肌自发性张力的影响,计算半数最大有效浓度(half maximal effective concentration,ECs0)。每次清洗并平衡1h后,依次加入工具药P2受体(嘌呤能)激动剂α-βmeATP(100μmol/L)、P2Y1受体(嘌呤能)拮抗剂MRS2500(1 pmol/L)、一氧化氮合酶(NOS,氮能)抑制剂 L-NAME(10μmol/L)、CCh、TTX 等,孵育适当的时间,给除α-βmeATP和胆碱受体激动剂卡巴胆碱CCh10-9 mol/L～10-3 mol/L)以外的药物予以电场刺激(EFS,40 V,2～30 Hz,0.5 ms pulse duration,and 10 s),观察IBS-D大鼠结肠肌张力的变化,判断其运动状态。在预孵育盐酸小檗碱(40μmol/L)后,观察并记录肌条的张力变化,并与无前面实验对比,判断盐酸小檗碱的作用。结果(1)盐酸小檗碱对IBS-D大鼠的药效学研究:与模型组比较,盐酸小檗碱中、高剂量组腹壁回缩反射评分(AWR)降低、粪便面积减少(P<0.05)。其中高剂量组药效最明显,与阳性药组有显著性差异(P<0.05)。与正常组比较,IBS-D模型组大鼠结肠5-HT3A、Myosin Va、nNOS的mRNA均有异常变化。慢性束缚应激模型IBS-D大鼠结肠5-HT3AR、Myosin Va的mRNA表达增加,而nNOS的表达降低,LC8、SLC17A9没有显著性差异,说明本研究建立的慢性束缚应激IBS-D大鼠模型的结肠的氮能神经传导可能发生异常改变,且可能有其他类神经传导发生变化。BBH给药组5-HT3AR、Myosin Va的mRNA显著降低,说明BBH可能会改善慢性束缚应激模型的异常改变。(2)盐酸小檗碱对IBS-D大鼠离体结肠平滑肌神经传导的调控作用:盐酸小檗碱可抑制结肠平滑肌自主收缩,呈现剂量依赖性,EC50为25.17μmol/L。其次,胆碱受体激动剂卡巴胆碱(CCh)可使平滑肌张力增加,且应激模型组的张力显著高于对照组(P<0.05)。盐酸小檗碱能拮抗胆碱受体激动剂卡巴胆碱(CCh)对平滑肌的作用,可显著降低平滑肌张力(P<0.05)。另外,L-NAME(10 μmol/L)可升高结肠平滑肌张力,使其出现收缩,且应激模型大鼠结肠平滑肌的张力显著高于对照组(P<0.05);但提前孵育盐酸小檗碱,可以拮抗L-NAME的收缩作用,是张力降低,成为舒张状态。再者,α-βmeATP可使平滑肌舒张,且对照组张力显著低于模型组(P<0.05),而预孵育盐酸小檗碱后,可以升高平滑肌张力,拮抗α-βmeATP的作用。MRS2500可使平滑肌张力升高,而预孵育盐酸小檗碱后,可以降低平滑肌张力,但仅在模型组有显著性差异(P<0.05)。结论小檗碱是黄连治疗IBS-D的主要有效活性成分,可明显改善IBS-D大鼠的内脏高敏感性及腹泻症状。该作用是通过调控肠神经传导来实现的,其机制可能是:在IBS-D的结肠平滑肌组织中,BBH可能提高NO释放水平、增加NOS的活性、增加nNOS mRNA表达水平;还可能竞争性拮抗胆碱能受体,此外还通过调节结肠神经递质5-HT表达等。而小檗碱P2受体拮抗剂和激动剂的作用表现不同,因此其对嘌呤能神经通路的作用尚不完全清楚,仍需进一步研究。小檗碱的这种多靶点调节作用最终表现为对结肠过度收缩状态的抑制作用,是其缓解IBS-D腹泻症状的重要药理机制。