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苜蓿由于水分含量高、可溶性碳水化合物含量低及缓冲能高等原因,直接青贮极易发生梭菌发酵导致失败。该文旨在研究参与苜蓿青贮发酵的梭菌种类、数量以及不同发酵时期优势梭菌菌群的演替规律,初步阐明梭菌增殖诱发梭菌发酵降低苜蓿青贮品质的机理。主要研究内容及结论如下:1.利用变性梯度凝胶电泳技术研究了 4个品种苜蓿[Sanditi(A1)、AC Caribou(A2)、WL319HQ(A3)及4030(A4)]未萎蔫(0-h)或萎蔫2h及4h(2-h、4-h)后密封贮藏14、28及56天后的青贮中的梭菌菌群构成。结果表明,Cl.sporgenes在未萎蔫A4青贮梭菌发酵过程中起主导作用,而其他3品种未萎蔫苜蓿青贮中梭菌发酵主要与Cl.perfringens的活动相关。与未萎蔫苜蓿青贮相比,萎蔫处理显著抑制了梭菌发酵,Cl.ghonii及Cl.sartagoforme的活动可能与萎蔫2-h组的苜蓿青贮(水分含量为64.6%-66.8%)中梭菌发酵相关;萎蔫4-h组的苜蓿青贮(水分含量为56.2%-58.4%)中梭菌发酵被完全抑制。2.利用高通量测序技术研究了苜蓿青贮过程中梭菌菌群动态变化。试验设置添加乳酸菌接种剂(105cfu/gFM)及蔗糖(20g/kgFM)的LS组以及未添加的CK组,于发酵后的第0、3、7、14、28 及 56 天取样分析。结果表明,Romboutsia sp.、Clostridium tyrobutyricum、Cl.perfringens、Garciella sp.及Terrisporobacter mayombei是附着在苜蓿表面的主要梭菌。青贮过程中,LS组发酵品质良好,其梭菌菌群构成在青贮前后无显著差异。CK组发生严重梭菌发酵,Cl.perfringens、Garciellasp.及Cl.baratii在发酵前3天快速增殖,随后Cl.perfringens及Cl.baratii成为优势梭菌,14天后Cl.tyrobutyricum在梭菌菌群中占据主导地位。因此推测,Cl.perfringens、G arciella sp.及Cl.baratii启动了 CK组苜蓿青贮过程中梭菌发酵,而Cl.tyrobutyricum主要在梭菌发酵后期起作用。3.利用分离纯培养法研究了苜蓿青贮中优势梭菌的菌群构成及其生理生化特性。根据形态学特征及生理生化试验将分离的65株梭菌划分为5个组,并结合16S rDNA序列分析将其分别鉴定为:Cl.tyrobutyricum(24.6%)、Cl.sordellii(7.7%)、Cl.sporogenes(18.5%)、Cl.subterminale(7.7%)及Cl.perfringens(41.5%),其中Cl.pefringens的含量最高。与其他4种梭菌相比,Cl.perfringens可以利用多种碳源底物并且可以在45℃及50℃的高温条件下生长。因此,有必要进一步研究 Cl.perfringens在梭菌发酵过程中的作用。4.利用高通量测序技术研究了接种Cl.perfringens对苜蓿青贮中梭菌菌群构成的影响。试验设置添加乳酸菌接种剂(105cfu/gFM)及蔗糖(20g/kgFM)的LS组以及未添加的CK组,在发酵后的第14、28及42天分别接种Cl.perfringen(103 cfu/g FM),并分别以调制青贮或接种梭菌为时间原点发酵56天后取样分析。结果表明,接种梭菌对LS组发酵过程无显著影响,而接种梭菌促进了 CK组梭菌发酵。与Clostridium相比,随贮藏时间延长,Garciella在CK组梭菌发酵过程中的作用更大。CK组青贮过程中,第28天接种梭菌组的梭菌发酵程度均比第14天或42天接种组更严重,这可能也与Garciella的活动有关。与Cl.perfringens相比,Garciella sp.及Cl.tyrobutyricum在CK组梭菌菌群中占据优势地位。因此推测,Garciella sp.及Cl.tyrobutyricum 的活动对促进CK组梭菌发酵的作用更大,而Cl.perfringens在促进梭菌发酵过程中的作用仍需进一步研究。