目的雌激素是女性体内非常关键的调节激素,在人体分布广泛,可调控女性的生殖、神经、心血管、骨骼等系统的功能,在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、骨质疏松、绝经后妇女综合征等多种疾病的发生发展和转归中起着重要作用；而雌激素发挥上述作用离不开其在靶细胞上的关键作用靶点——雌激素受体(Estrogen receptor, ER)。ER有ERα和ERβ两种亚型,位于胞浆或胞核内,具有转录因子的作用。雌激素与ER结合,形成二聚体,然后与雌激素受体反应元件(estrogen response element, ERE)结合,刺激靶基因转录,从而调节雌激素促进细胞增生、分化和维持正常的生理功能。其信号传导过程属于基因型慢效应途径。近年来多项研究发现,雌激素对靶细胞的作用除了基因型慢效应外,还有非基因型快速效应。研究表明,存在一种膜性受体——G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor, GPER),雌激素与该受体结合,反式活化表皮因子生长受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、调节细胞外信号调节激酶(extracellular regulate kinase, ERK)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)等激酶活性,从而激活相应的信号转导通路,引发非基因型快速效应,使雌激素敏感器官产生细胞增殖反应,广泛参与机体的病理生理调控。与内源性雌激素结构类似的植物雌激素(phytoestrogen, PE),也可通过与体内相应的雌激素受体结合发挥雌激素和抗雌激素双重效应。中药丹参是唇形科植物丹参的干燥根及根茎,具有活血祛瘀、凉血消痈、清热安神等功效。现代药理研究表明,丹参在生物体内可参与多项重要的生命活动,表现出保护心血管、增强机体免疫功能、抗菌、抗炎、抗氧化、镇痛、抗衰老等多方面药理效应,特别是在多个靶器官都具有抗肿瘤的功效。其主要活性成分丹参酮ⅡA是丹参酮发挥药效作用的重要物质基础,具有植物雌激素药理功效,其药理作用靶点和途径的揭示将为药物的临床应用提供重要的实验依据。本课题主要研究丹参酮ⅡA对宫颈癌siha细胞、乳腺癌T47D细胞和子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的抑制效应及其ER介导途径。方法采用MTT法检测细胞活性,间接反映细胞增殖；应用流式细胞技术检测细胞周期；应用Western blot法检测相应雌激素效应蛋白表达。结果1.丹参酮ⅡA对宫颈癌siha细胞、乳腺癌T47D细胞、子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的影响应用人的宫颈癌siha细胞、乳腺癌T47D细胞、子宫内膜癌Ishikawa细胞为研究载体,丹参酮ⅡA为研究对象,通过MTT方法检测细胞增殖情况。1.1检测不同浓度丹参酮ⅡA对宫颈癌siha、乳腺癌T47D细胞、子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的影响结果：通过MTT法进行细胞增殖试验,与对照组相比,丹参酮ⅡA表现出抑制宫颈癌siha细胞、乳腺癌T47D细胞、子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖作用,且表现出一定的剂量依赖性。1.2检测ER完全拮抗剂ICI182 780、ERα拮抗剂MPP、ERβ拮抗剂PHTPP干预下宫颈癌siha细胞、乳腺癌T47D细胞增殖变化结果：(1)ERa拮抗剂MPP可增强丹参酮ⅡA对宫颈癌siha细胞增殖的抑制作用：ERβ拮抗剂PHTPP可减弱丹参酮ⅡA对宫颈癌siha细胞增殖的抑制作用。(2)ER完全拮抗剂I(CI182 780可显著增强丹参酮ⅡA对乳腺癌T47D细胞增殖的抑制作用。2.丹参酮ⅡA对宫颈癌siha、乳腺癌T47D细胞周期的影响应用人的宫颈癌siha、乳腺癌T47D细胞为研究载体,丹参酮ⅡA为研究对象,通过流式细胞术检测细胞周期变化。结果：选取药物作用效果显著的48h检测细胞周期,发现雌二醇对宫颈癌siha乳腺癌T47D细胞增殖指数有明显升高作用。而丹参酮ⅡA可使宫颈癌siha、乳腺癌T47D细胞增殖指数显著降低,与雌二醇的作用趋势相反,主要表现在S期细胞比例明显降低,而Go/Gl期细胞比例明显增加。3.丹参酮ⅡA对宫颈癌siha细胞、乳腺癌T47D细胞、子宫内膜癌Ishikawa细胞雌激素效应蛋白的表达3.1以siha细胞为载体,应用Western blot方法观察丹参酮ⅡA对p-ERK、cyclin D两种蛋白表达的影响,从蛋白水平探讨丹参酮ⅡA发挥植物雌激素样作用的机制。结果：丹参酮ⅡA可使宫颈癌siha细胞p-ERK和cyclin D表达水平显著降低,且表现出一定的剂量依赖性。3.2以T47D细胞为载体,应用Western blot方法观察丹参酮ⅡA对GPER、p-ERK、cyclinD三种蛋白表达的影响,从蛋白水平探讨丹参酮ⅡA发挥植物雌激素样作用的机制。结果：丹参酮ⅡA作用与雌二醇作用相反,可使乳腺癌T47D细胞GPER、p-ERK、cyclinD蛋白表达水平显著降低,且表现出一定的剂量依赖性。3.3以Ishikawa细胞为载体,丹参酮ⅡA为研究对象,应用Western blot方法,观察丹参酮ⅡA对Ishikawa细胞中cyclin D蛋白表达量的影响。结果：丹参酮ⅡA作用与雌二醇作用相反,可使乳腺癌Ishikawa细胞cyclin D蛋白表达水平显著降低,且表现出一定的剂量依赖性。4.基因沉默技术构建GPER阴性的细胞模型以及通过MTT方法检测GPER SiRNA T47D细胞增殖情况4.1 Western blot检测GPER表达量。结果：显示GPER SiRNA转染组与对照组相比,GPER蛋白表达明显减低,说明转染GPER SiRNA可构建GPER蛋白表达水平明显降低的T47D细胞模型。4.2检测不同浓度丹参酮ⅡA对GPER SiRNA T47D细胞增殖的影响。结果：雌二醇可使T47D细胞增殖速率增加,转染GPER SiRNA后其促增殖作用明显减弱。丹参酮ⅡA对T47D细胞增殖具有明显抑制作用,转染GPER SiRNA丹参酮ⅡA抗增殖作用进一步增强。5.不同浓度的丹参酮ⅡA对子宫内膜癌细胞凋亡的影响应用Hoechst 33342染色,在荧光显微镜下进行子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡形态学变化。结果：Hoechst33342荧光染色结果显示,对照组中Ishikawa细胞染色质均匀,核形态规则,给药组细胞呈现致密浓染荧光,细胞形态呈现出细胞凋亡现象。结论1、丹参酮ⅡA可以抑制宫颈癌siha细胞的增殖活性,降低细胞增殖指数,下调p-ERK和cyclin D蛋白的表达水平。2、丹参酮ⅡA可以抑制乳腺癌T47D细胞的增殖活性,降低细胞增殖指数,该作用通过GPER途径实现。3、丹参酮ⅡA可以抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖活性,并诱导该细胞凋亡,还可以抑制cyclin D蛋白的表达。