【摘 要】
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细胞因子是免疫系统中细胞之间互相传递信号的小蛋白质或糖蛋白信使分子。细胞因子的检测对于监测细胞间信息传递,以及生物学和医学至关重要,同时可以作为很多疾病的生物标志物。然而,大多数细胞因子含量极少（pM范围）,种类繁多,并具有多种多样的生物学功能,这些特性使细胞因子网络变得很复杂。研究表明,一种生物现象通常是不同细胞因子之间相互作用的结果。单细胞因子的测量价值有限,因此迫切需要开发能够同时测量多种细
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细胞因子是免疫系统中细胞之间互相传递信号的小蛋白质或糖蛋白信使分子。细胞因子的检测对于监测细胞间信息传递,以及生物学和医学至关重要,同时可以作为很多疾病的生物标志物。然而,大多数细胞因子含量极少（pM范围）,种类繁多,并具有多种多样的生物学功能,这些特性使细胞因子网络变得很复杂。研究表明,一种生物现象通常是不同细胞因子之间相互作用的结果。单细胞因子的测量价值有限,因此迫切需要开发能够同时测量多种细胞因子的可靠,低成本,和易操作的检测技术。近年来,电化学生物传感器因其简单,低成本,高速度,高通量检测和高灵敏度而越来越受欢迎。目前纳米材料已经应用到电化学生物传感器领域,极大地提高了该传感器的灵敏度。同时传感界面引入了单克隆抗体,提高了其特异性。并且适配体由于具有尺寸更小,合成成本更低,稳定性强,易于修饰等特性逐渐取代了抗体在传感界面的应用。因此,基于抗体或适配体的电化学生物传感器可以很好地应用到多种细胞因子的定量和同时检测。本文首先制备并表征了基于氧化石墨烯功能化的纳米探针,作为信号单元,以此构建基于抗体的氧化石墨烯功能化的电化学免疫传感器对多种细胞因子进行同时检测。接着将电化学传感技术和可实现结构转换的适配体结合,以此构建基于适配体的电化学生物传感器并用于细胞因子的定量检测。最后设计了一种用于多种细胞因子同时检测的基于适配体的电化学生物传感器,并验证了其可行性。现将本论文的研究内容概述如下:（1）纳米探针的制备和表征:将氧化还原探针尼罗蓝（NB）,亚甲基蓝（MB）和二茂铁（Fc）分别通过π-π共轭装载到GO中来制备三种基于氧化石墨烯（GO）的GO-NB,GO-MB和GO-Fc纳米复合材料。然后经过EDC/NHS的MES溶液活化,将其分别与IL-6,IL-1β和TNF-α的多克隆抗体共价连接,以获得Ab2-GO-NB,Ab2-GO-MB和Ab2-GO-Fc纳米探针,作为信号单元。并且对GO-NB,GO-MB和GO-Fc进行电化学表征,红外光谱表征,拉曼表征和紫外光谱表征。（2）构建基于抗体氧化石墨烯功能化的电化学生物传感器并用于IL-6,IL-1β和TNF-α的定量同时检测。采用重氮盐化学将4-羧基苯基和4-氨基苯基磷酸胆碱（PPC）的混合层共价修饰到玻碳电极（GC）表面以此构建传感界面,接着经EDC/NHS溶液活化羧基后,将捕获IL-6,IL-1β和TNF-α的单克隆抗体通过酰胺键共价修饰到羧酸终止的传感界面上以形成夹心测定。通过观察来自信号单元Ab2-GO-NB,Ab2-GO-MB和Ab2-GO-Fc的电化学信号的变化来实现IL-6,IL-1β和TNF-α三种细胞因子的定量同时检测。（3）构建基于适配体氧化石墨烯功能化的电化学生物传感器并用于IFN-γ定量检测。首先将多个MB探针分子装载在IFN-γ适配体的发卡型结构里,形成aptamer（MB）信标分子,接着将其修饰在涂覆有GO和链霉亲和素混合层的玻碳电极上来构建传感界面。IFN-γ和信标分子的茎环部分有高度的亲和性,当加入IFN-γ后,aptamer（MB）的发卡型结构发生转换,使其茎秆部分打开,致使嵌入其中的MB分子释放出来,以此增加电化学信号。从而制备一个稳定的,可重复使用,并且无试剂,高灵敏的装载多个MB探针分子的适配体传感器。并与MB标记适配体的电化学生物传感器的工作性能进行了比较。（4）最后,根据前两种构建的电化学生物传感器,设计了一种基于适配体GO功能化的电化学传感器用于VEGF,IFN-γ和TNF-α细胞因子的实时定量同时检测。
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