研究背景:　　肝癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,其全球发生率和死亡率在恶性肿瘤中分别占据第六位和第三位.我国肝癌的发生率和死亡率在恶性肿瘤中分别占据第四位和第三位.早期肝癌生存期可超过5年,而晚期肝癌生存期只有3个月左右[2].因此研究肝癌发生发展的机制具有重要的意义.能量代谢重编程是肿瘤的特征之一,不仅为肿瘤细胞生存提供能量,还为肿瘤细胞生存所需物质的生物合成提供原料,对于肿瘤的增殖、迁移和侵袭具有重要的意义.线粒体作为细胞能量代谢中心,其功能的改变必然会参与肿瘤细胞能量代谢重编程的过程当中,因此线粒体异常在肿瘤细胞的发生发展中发挥着重要的作用.Rap1属于小分子G蛋白Ras超家族,主要表现为无活性的GDP结合形式和有活性的GTP结合形式,调节包括细胞粘附,迁移,极性,分化,生长和血管生成在内的多种细胞过程,与胃癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症的发生、发展相关.　　目的:　　1.Rap1是小分子G蛋白Ras超家族成员,在鸟苷酸交换因子的作用下由无活性状态转变为有活性状态,通过与其他蛋白相互作用来发挥作用.多项研究表明Rap1参与多种细胞过程,如细胞生长与分化等,促进胃癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症的发生发展.然而,关于Rap1在肝癌中发挥的作用目前尚不清楚,因此我们想通过此项研究来明确 Rap1对肝癌的发生发展是否有一定的影响.我们从组织水平和细胞水平对Rap1于肝癌的关系进行了研究.　　2.为了明确Rap1是否确实影响肝癌的发生发展进程,我们对Rap1敲低的肝癌细胞进行体外细胞生物学功能变化分析.　　3.已有研究表明,中枢神经系统中的Rap1参与机体能量平衡和葡萄糖稳态;Epac2-Rap1信号调节心脏内氧自由基的产生.然而,关于Rap1对线粒体的功能及细胞能量代谢之间的具体的影响及相关机制尚不清楚.因此,我们想通过此项研究来明确Rap1对线粒体功能及细胞能量代谢是否有一定影响及相关影响机制.我们对Ra p1敲低的肝癌细胞进行线粒体功能相关实验,并且对细胞代谢途径进行了分析.　　4.线粒体是细胞能量工厂,癌症的发生发展离不开线粒体的作用.如果Rap1在肝癌的发生发展中起到一定的调控作用,且Rap1能够影响线粒体功能及细胞能量代谢,那么Rap1能否通过影响线粒体功能及细胞能量代谢进而影响肝癌的发生发展?如何影响?　　方法:　　1.首先,我们对 TCGA 数据库肝细胞癌组织和正常癌旁组织基因芯片进行分析,对 28 个病人的肝细胞癌组织及正常组织进行免疫组织化学染色实验,对20个病人的新鲜肝细胞癌组织及正常组织进行Western Blot实验,检测肝细胞癌与癌旁组织中Rap1的表达水平,比较其差异.　　2.选取一株肝癌细胞,通过转染siRNA,构建Rap1敲低的细胞模型.　　3.在 Ctrl 细胞和 Rap1 敲低细胞内进行细胞平板克隆实验、划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验,比较其差异.　　4.在Ctrl细胞和Rap1 敲低细胞内进行细胞内ATP生成实验、线粒体膜电位(MMP)实验、线粒体压力实验,比较其差异.　　5.在Ctrl细胞和Rap1 敲低细胞内进行荧光定量PCR实验,检测Rap1对肝癌细胞线粒体DNA拷贝数和线粒体编码亚基mRNA的影响.　　6.在Ctrl细胞和Rap1 敲低细胞内进行糖酵解压力实验,明确Rap1对肝癌细胞代谢途径的影响.　　结果:　　1.通过对TCGA数据库肝细胞癌组织和正常癌旁组织基因芯片进行分析、对病人的肝细胞癌组织和正常组织进行免疫组织化学染色实验、Western Blot 等实验,我们可以看到不管是在蜡块组织还是在新鲜组织中,肝细胞癌组织中Rap1的表达量明显高于癌旁组织,通过统计学分析可知具有统计学意义.　　2.通过查阅文献我们选取一株肝癌细胞:HuH7.通过对肝癌细胞转染siRNA,构建 Rap1 敲低的细胞模型,可以看到在 Rap1 敲低细胞内 Rap1表达量明显下降.　　3.通过细胞平板克隆、划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验检测Rap1对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,可以看到Rap1 敲低细胞相较于 Ctrl 细胞克隆形成数量较少,迁移距离较少,小室下层细胞穿过的较少,通过统计学分析可知具有统计学意义.　　4.通过ATP生成实验、线粒体膜电位(MMP)、线粒体压力检测实验检测Rap1对线粒体功能的影响,可以看到Rap1 敲低细胞相较于Ctrl细胞,细胞内 ATP 生成量较多,线粒体膜电位水平较高,细胞氧耗率(OCR)较高,通过统计学分析可知具有统计学意义.　　5.通过荧光定量PCR实验检测 Rap1对肝癌细胞线粒体DNA拷贝数和线粒体编码亚基 mRNA 的影响,可以看到 Rap1 敲低后细胞线粒体 DNA拷贝数和线粒体编码亚基mRNA升高.　　6.通过糖酵解压力检测实验检测Rap1对代谢途径的影响,可以看到加入葡萄糖(glucose)后,Rap1 敲低细胞相较于Ctrl细胞氧耗率(OCR)与胞外产酸率(ECAR)比值较高,通过统计学分析可知具有统计学意义.　　结论:　　1.Rap1体内促进肝细胞癌的发生.　　2.Rap1促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力.　　3.Rap1抑制肝癌细胞线粒体功能.　　4.Rap1抑制肝癌细胞线粒体DNA复制和转录.　　5.Rap1促进肝癌细胞代谢途径由有氧化磷酸化途径转变为有氧糖酵解途径.