脑淋巴引流对脑脊液的循环具有重要作用[1]。研究结果证实,脑淋巴引流途径受阻可引起脑脊液循环障碍及血浆蛋白等大分子物质潴留,由此导致脑水肿及脑组织结构异常与功能障碍,形成淋巴滞留性脑病[2](lymphostatic encephalopathy, LE)。LE在人类病理学中占有重要地位,引发人类LE的主要原因是肿瘤治疗过程中颈部淋巴结清除及放射治疗等。随着肿瘤发病率的不断增长,摘除淋巴结的肿瘤治疗措施导致颈部淋巴系统功能障碍的患者数量也在持续增加。人类LE的主要症状为神情淡漠,记忆力下降,自主活动减少,精力不能集中、头痛、眩晕、恶心与呕吐等。LE导致的全脑缺血缺氧损伤不仅影响脑组织的形态和功能,同时还可影响大脑对外周组织器官的调节功能,加重患者原有疾病的病情与临床表现,可能影响医生对患者病情的准确诊断与治疗。研究发现LE大鼠自主神经系统(ANS)调节能力的改变,将引起血压、心率调节能力下降,但目前对这方面的研究尚不够系统与深入。因此充分了解LE的发生、发展过程及其对脑组织和外周器官的病理危害将具有重要意义。心率变异性(heart rate variability, HRV)是反映自主神经系统(autonomic nervous system, ANS)对心血管调节的重要指标,已广泛地应用于间接评价ANS对心血管功能的调节[3]。延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulls, RVLM)是交感神经与心血管功能重要的整合中枢,接受来自中枢其他部位和外周传入的多种心血管活动信息,并有下行通路直接投射到胸段脊髓灰质中间外侧柱的交感节前神经元,从而调节交感心血管活动[4],对HRV具有重要作用。体温是维持正常代谢的重要指标,其变化对心血管功能具有重要的影响。本研究拟通过观察LE大鼠HRV指标的变化、RVLM区的形态与超微结构的改变、体温的变化、eNOS蛋白表达的变化,了解LE对心血管调节功能及体温的影响及其可能的影响机制,并探讨RVLM区结构损伤与HRV改变的关系。研究目的1.观察LE对RVLM组织形态结构的影响；2.评价LE对ANS系统调节功能的影响；3.了解LE对体温调节功能的影响；4.探讨LE所至HRV改变与体温改变的相关性；5.研究RVLM结构损伤与HRV改变的关系；研究方法1.实验动物及分组成年雄性Wistar大鼠,体重250-300g,80只。由山东大学实验动物中心提供。随机将Wistar大鼠分为假手术组(SHAM组)、淋巴滞留性脑病组(LE组),每组又分术后1、7、14、21d组,每组10只。2.LE动物模型的建立参照文献用阻断颈部淋巴引流的方法制备大鼠淋巴滞留性脑病模型。具体操作如下：戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉,仰卧固定。无菌条件下,沿颈部正中切开皮肤,依次分离颈部两侧下颌、颈浅淋巴结,结扎其两端的输入、输出淋巴管,摘除相应淋巴结。然后逐层分离皮下组织、肌层,在颈总动脉及迷走神经的后外侧分离出颈深淋巴结,结扎并摘除颈深淋巴结。逐层缝合切口。假手术组不结扎淋巴管,亦不摘除淋巴结,其余手术步骤同实验组。3.行为学分析每组实验动物在手术结束后的1、7、14、21天分别进行行为学评分。评分方法参照缺血模型Lemay法分级标准和Sun等的分级评分方法并加以调整。4.心电、体温信号提取与HRV分析各组分别于术后1、7、14、21天用戊巴比妥钠腹腔麻醉(35mg/kg)。心电传感器记录标准肢体Ⅱ导联心电信号,温度传感器监控体温。使用AD Instrument PowerLab system,持续采样30分钟,采样率2kHz。取其中5分钟平稳的信号进行短时心率变异性分析。选择HRV分析模块,对选定的心电信号进行HRV分析。提取具有代表意义的参数,包括：心率变异时域指标：MEAN(全程所有R-R间期的平均值)、SDNN (全程所有R-R间期的标准差)、RMSSD(全程相邻R-R间期差值的均方根)及频域指标：LF(低频能量,0.04<LF<0.15Hz)、HF(高频能量,0.15<HF<0.4Hz)与LF/HF(低高频能量比)。5.组织学观察SHAM组和LE组,每组取3只大鼠于心电信号测量完成后取脑组织的延髓头端腹外侧区(RVLM)作石蜡切片,进行H&E染色光镜观察。并对该组织行超薄切片作电镜观察。6. Western Blot应用Western blotting技术检测LE对各组大鼠脑组织RVLM内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响。7.数据统计分析：数据的统计分析采用SAS V9.0Chinese。利用UNIVARIATE过程对HRV各指标进行了正态性检验。差异性检验方法采用基于Wilcox得分的一维非参数检验分析方法。结果1.对大鼠行为学指标的影响SHAM组的大鼠没有神经功能缺损的行为学表现。与SHAM组大鼠相比,LE组的大鼠神经功能缺损得分显著偏高(p<0.05),主要表现为嗜睡、活动减少、动作迟缓、对刺激反应淡漠,毛发蓬乱缺少光泽、肌张力降低等；上述行为表现在LE术后第三天即可出现,但通常到第21天会慢慢消失。2.对HRV的影响时域指标：①所测全程R-R间期平均值(MEAN):LE组大鼠自术后第7天起显著延长(P<0.05),与SHAM组比较术后7、14及21天均有显著差异。MEAN增大说明心率减慢。②全程所有R-R间期的标准差(SDNN):LE组术后第7至14天显著增加(P<0.05),与SHAM组比较有显著性差异。SDNN增大说明心率变异性增加,心血管调节功能下降。③全程相邻R-R间期差值的均方根(RMSSD):LE组术后第1、7、14天与SHAM组比较均显著增加(P<0.05)。RMSSD增大说明淋巴滞留性脑病导致迷走神经调节功能增强。频域指标：①低频能量(LF)：SHAM组和LE组在各时间点均未表现出显著性差异(P<0.05)。说明淋巴滞留性脑病对交感神经影响不明显。②高频能量(HF)：LE组自术后第7天比SHAM组显著增大(P<0.05),直至术后第14天,第21天恢复正常。HF增大反映了迷走神经调节功能增强,与RMSSD的改变一致。③低频高频能量比(LF/HF):LE组较SHAM组术后7至14天显著降低(P<0.05),LE组与SHAM组比较有显著性差异。LF/HF是交感迷走神经平衡的重要标志,该比值降低反映了交感迷走神经平衡被破坏,迷走神经的调节功能在平衡中占主要地位。3.对大鼠脑组织形态结构的影响HE染色与光镜观察：SHAM组大鼠脑组织神经细胞分布均匀、胞核大而规则、边界清晰,呈圆形或椭圆形,染色较淡,核仁清晰、染色较深,血管正常。与SHAM组相比,LE组大鼠脑组织神经细胞分布稀疏,体积变小,排列不整齐,有些神经元、神经胶质细胞肿胀、变性、坏死。部分神经元周围及胞质内有空泡。血管外膜与周围脑组织出现明显空隙。上述变化于LE术后自第7天开始出现,第7-14天最为明显,以后逐渐改善。超微结构观察：SHAM组无神经细胞凋亡,髓鞘的结构致密、排列整齐,血管内皮细胞结构正常。与SHAM组相比,LE组改变明显,表现为核固缩、染色质浓染、核膜不清晰；髓鞘疏松、破裂。毛细血管基底膜肥厚,外膜呈半月形或不规则形扩张,内含大量水肿液。上述形态改变于术后第7天最明显。4.对体温调节的影响研究显示LE组,伴随LE的发展,体温呈逐渐下降的趋势。LE组体温与疾病进程负相关。(r=-0.42589,p=0.0005)。LE组术后第1天与SHAM组比较差异不显著；但第7天、14天与SHAM组有显著差异(p<0.05)；第21天伴随LE损伤的减轻与SHAM组比较差异已不显著。进一步分析显示LE组体温与心率变异的多项参数间存在相关关系,而SHAM组这种相关关系不存在。5.对eNOS蛋白表达的影响Western blotting结果显示,与SHAM组比较,LE组eNOS蛋白表达于术后第7天,第14天显著降低(P<0.05)。结论1.LE导致ANS调节功能的损伤,表现为心率降低、HRV增加,使交感迷走平衡被打破,迷走神经在交感迷走平衡中占主导地位。2.LE可损伤RVLM区的神经元、毛细血管及髓鞘等结构。3.LE损伤体温调节能力,造成体温下降。4.LE所致体温下降的程度与HRV变化的程度有相关性。5.LE大鼠HRV改变的时间、程度与RVLM区损伤发生的时间、程度存在一致性,说明RVLM区结构的损伤与LE所致的ANS调节能力的损伤密切相关。