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目的:结直肠癌是国内外常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高。在我国结直肠癌发病率居第四位,死亡率居第四位。2018全球癌症年报显示结直肠癌发病率10.2%,在全球新发癌症发病率中排第三。远处转移是结直肠癌患者治疗失败的主要原因。肝脏是血行转移最主要的靶器官,约20%-34%的患者在临床确诊时已有肝转移。结直肠癌肝转移也是结直肠癌患者最主要的死亡原因。目前肝转移发生的机制尚不清楚,早期检测有意义的生物标志物是改善结直肠癌患者生存的关键。因此,从基因水平寻找与结直肠癌肝转移有关的一系列变化,探讨结直肠癌肝转移发生、发展的分子机制,对改善结直肠癌肝转移患者的预后,并找到有效治的治疗靶点极为重要。FOXP3(Forkhead Box P3)是一种转录因子。已经发现FOXP3是调节性T细胞(Tregs)的重要标志基因,参与精确调控Tregs细胞的发展和功能。但是,最近的研究发现FOXP3基因在多种肿瘤细胞中表达。提示FOXP3可能参与肿瘤细胞的发生发展。目前在肠癌细胞中FOXP3表达及发挥的功能和机制还不清楚,相关的生物学行为仍不明确。本研究中,我们旨在探讨FOXP3在肠癌组织及肝转移组织中的表达、功能及其参与调控肠癌肝转移的机制,为肠癌肝转移患者的预后预测和治疗提供新的策略。研究方法:1、采用免疫组化技术检测癌旁组织、肠癌组织及肝转移组织中FOXP3蛋白的表达;2、应用TCGA(The Cancer Genome Atlas)及GEO(Gene Expression Omnibus)数据库及本中心临床随访数据分析FOXP3表达与肠癌患者临床病理参数间的关系;3、转染si RNA建立FOXP3敲减的瞬转细胞株;4、慢病毒转染沉默及过表达FOXP3建立稳转细胞株;5、采用CCK8实验检测细胞增殖能力;6、采用流式技术检测细胞周期变化;7、采用Transwell法测定细胞迁移和侵袭能力;8、采用免疫共沉淀法检测蛋白质相互结;9、采用非靶代谢质谱分析FOXP3影响细胞代谢小分子的改变;10?采用荧光素酶实验、PCR、Western bolt检测Wnt信号通路激活;11、采用免疫荧光实验检测β-连环蛋白(β-catenin)入核变化;12、采用裸鼠肠癌肝转移瘤模型进行体内研究;13、统计学分析:采用R软件及Graphpad统计软件进行统计学分析。所有实验结果均重复3次,并以均值±标准差(x±s)表示。P<0.05认为有统计学意义。结果:1、FOXP3在肠癌组织及肝转移组织中高表达。临床病理资料回顾分析显示,FOXP3的高表达与淋巴结转移、TNM分期及同时性(或异时性)肝转移相关。2、GEO及TCGA数据库分析结果表明,FOXP3在结直肠癌中的表达与KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog)突变状态、微卫星不稳定性(Microsatellite instability,MSI)显著相关,而与(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)BRAF突变状态不相关。3、FOXP3促进肠癌细胞体内增殖。细胞增殖-毒性检测实验CCK8提示,沉默FOXP3后肿瘤细胞增殖能力降低,过表达FOXP3后其增殖能力升高。4、FOXP3促进肠癌细胞侵袭及迁移能力。Transwell实验结果提示,沉默FOXP3后,RKO及HT29细胞迁移及侵袭能力减弱,过表达FOXP3后细胞迁移及侵袭能力增强。5、体内研究证明裸鼠体内FOXP3促进肠癌细胞增殖。应用慢病毒过表达及敲减RKO细胞中FOXP3的表达水平,裸鼠腋窝皮下注射,28天后,沉默FOXP3组裸鼠腋窝处皮下肿瘤体积明显小于对照组小鼠,而过表达组肿瘤体积较对照组增大。4、体内研究证明裸鼠体内FOXP3促进肠癌细肝转移。免疫荧光、qPCR及Western blot充分验证利用慢病毒转染RKO细胞中过表达及沉默FOXP3的效率后,裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞,过表组肝转移瘤较对照组明显增多,而沉默组较对照组肝转移瘤减少。8、FOXP3促进肠癌细胞上皮细胞-间充质转化。qPCR及免疫印迹实验结果显示,沉默FOXP3后E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9的mRNA表达水平下降,过表达FOXP3后E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9的表达水平上升。9、FOXP3促进β-catenin入核。免疫荧光实验结果显示在肠癌细胞中过表达FOXP3后,增多的β-catenin主要定位在核中,提示FOXP3促进β-catenin入核。10、FOXP3与TCF4直接结合共激活Wnt信号通路。GSEA分析提示FOXP3升高后Wnt/β-catenin信号通路显著激活。双荧光素酶报告基因实验验证FOXP3激活Wnt/β-catenin信号通路。免疫共沉淀实验证实FOXP3与TCF4直接结合。QPCR及免疫印迹实验证明过表达FOXP3促进Cyclin D1、C-myc表达增高。反之,敲减FOXP3后Cyclin D1、C-myc表达下调。11、过表达FOXP3同时沉默TCF4逆转FOXP3促进细胞侵袭、迁移的作用。Treswell实验结果显示,过表达FOXP3后细胞侵袭能力上升,同时用siRNA沉默TCF4后,较FOXP3过表达组比较,细胞侵袭能力下降。12、过表达FOXP3同时沉默TCL4逆转FOXP3上调E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9、Cyclin D1及C-myc的表达。13、FOXP3抑制甲硫氨酸循环循(S-adenosyl methionine,SAM),减低MMP9启动子甲基化,促进MMP9表达。非靶代谢组学分析提示:FOXP3沉默后,对SAM循环的抑制减低,相关代谢产物增加,提示FOXP3抑制SAM循环;QPCR及免疫印迹实验证明FOXP3抑制SAM循环呈浓度依赖性,SAM循环抑制后减低MMP9启动子甲基化,促进MMP9表达,进而参与调控肠癌细胞的代谢重编程,促进肠癌肝转移。结论:FOXP3在肠癌及肝转移组织中高表达发挥癌基因的功能,促进肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移;FOXP3的表达与肠癌分期、同时性肝转移的发生、KRAS突变以及MSI-H(dMMR)状态相关;FOXP3促进肠癌细胞上皮-间充质转化,通过促进β-catenin入核并于TCF4直接结合形成转录共刺激因子,激活经典的Wnt/β-catenin信号通路促进肠癌肝转移;FOXP3通过影响甲硫氨酸循环的SAM代谢促进MMP9表达,进而促进肠癌肝转移的发生。