糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后又一高死亡率的疾病，严重威胁着人类的身心健康，由于尚无满意的理论完全阐明其病因和发病机制，故对糖尿病治疗方法的探索和糖尿病机制的研究成为众多科研工作者关注的焦点。目前对糖尿病的治疗仍然是以药物治疗为主，不能从根本上解决糖尿病的问题。因此，现代医学对胰岛移植和基因疗法愈来愈关注。本文拟利用与胰腺发育密切相关的PDX-1基因诱导肝细胞向胰腺细胞分化，以期能够在糖尿病治疗中得到应用。这方面的研究将为糖尿病的治疗开拓一个新的思路。Ⅰ型及部分Ⅱ型糖尿病是由于胰岛β细胞凋亡异常增多而使得β细胞数目减少，致使胰岛素分泌不足而引起的。胰腺-十二指肠同源框1（pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）作为胰腺发育过程中重要的转录因子指导胰腺的正常发育。PDX-1可以调节影响胰岛β细胞特性和功能的基因的表达，这些基因包括：胰岛素（insulin）、葡萄糖转移蛋白-2(glucose transporter2，GLUT-2)、葡萄糖激酶(glucokinase)、淀粉样多肽(amyloid polypeptide)等；同时它也调节生长激素在δ细胞和发育脑中的表达。PDX-1激活基因的转录是组织特异性的，这依赖于它与其它转录因子相互作用的能力。如在胰岛素的启动子中，PDX-1的DNA结合位点排列在E盒的附近，并结合E47蛋白和NeuroD1蛋白形成起始复合物，从而调节胰岛素基因的转录。PDX-1在胰腺的发育中有两个表达高峰期，第一个表达高峰期是在内胚层时，PDX-1决定哪一部分发育为胰腺，在第二个表达高峰期，PDX-1<WP=64>和Nkx6.1、NeuroD1一起作为β细胞分化因子起作用。近来的研究表明，通过导入PDX-1基因，能够使成熟的肝细胞或是具有分化潜能的胎肝细胞分化成胰腺细胞，为糖尿病的治疗开拓了新的思路。鉴于PDX-1基因与胰腺组织发育及胰岛素分泌的密切相关性，并依据已有的研究成果，本研究的重点是探讨PDX-1基因诱导肝细胞向胰腺细胞分化作用，为糖尿病的基因治疗奠定基础。为此，克隆了人、小鼠、大鼠的PDX-1基因编码区序列，构建了PDX-1真核细胞表达载体，转染小鼠胎肝基质细胞，诱导其向具有胰腺功能细胞分化，并构建了PDX-1基因与VP16基因融合表达载体，为在人肝细胞中的应用创造了条件。此外，本研究还进行了中药复方合剂糖灵对STZ致糖尿病动物模型的初步药效学实验，研究表明糖灵有较好的降血糖作用。主要工作及结果概述如下：PDX-1基因编码区序列的克隆分析及真核表达载体的构建分析PDX-1基因序列的特点，设计上下游引物，通过RT-PCR方法从人、小鼠、大鼠的十二指肠组织中扩增到人、小鼠、大鼠的PDX-1基因编码区的完整序列并成功构建了其真核表达载体pcDNA3-PDX-1，经测序和blast分析，证实了该片段序列正确。对其同源性、保守区域、功能区域以及染色体定位等进行了分析比较，人与小鼠、大鼠的PDX-1基因的核苷酸序列同源性均为83%，氨基酸序列的同源性分别达到88%和89%。并发现其基因编码区氨基酸序列的146-206位在大多数的哺乳动物之间是高度保守同源的，这段序列作为DNA的结合位点对胰腺的正常发育是必须的。同源区上游的FPWMK序列可与胰腺外分泌部发育相关的PBX蛋白相互作用，指导胰腺外分泌细胞的正常分化。 <WP=65>小鼠胎肝基质细胞向胰腺细胞诱导分化的研究利用第一部分构建的小鼠的pmPDX-1质粒和pcDNA3质粒分别转染永生化的小鼠胎肝基质细胞，将PDX-1基因导入细胞，使其发挥功能。通过RT-PCR的方法，检测转染pmPDX-1质粒的小鼠胎肝基质细胞，在mRNA水平上能够检测到胰岛β细胞所分泌的胰岛素，胰岛α细胞所分泌的胰高血糖素，同时能够检测到胰腺PP细胞所分泌的胰多肽，表明转染了pmPDX-1质粒的小鼠胎肝基质细胞在向胰腺细胞分化的过程中，具备了表达胰腺的内外分泌因子的能力。此外，对肝细胞生长因子受体c-met的检测，提示分化的细胞没有完全失去肝细胞的特性。PDX-1基因与VP16融合表达载体的构建在成熟的肝细胞中，PDX-1通常需要其他的辅助因子结合于靶基因的转录活性区，才能启动肝细胞向胰腺细胞的分化，vp16可替代这些辅助因子发挥作用。本部分内容是将第一部分工作中得到的大鼠PDX-1基因编码区序列克隆到pIRES2-EGFP载体中得到重组质粒prPDX1-EGFP，然后将VP16活性结构区亚克隆到重组质粒prPDX1 -EGFP 的PDX-1的C端，成功构建了PDX-1基因与VP16活性结构区融合表达的载体，为进行成熟肝细胞分化成胰腺细胞的工作奠定了基础。中药复方合剂糖灵对STZ致糖尿病动物模型的药效研究成功建立了STZ致高血糖糖尿病小鼠的动物模型；初步观察了中药复方合剂糖灵对STZ致高血糖糖尿病小鼠的降糖效果，给予中药复方合剂治疗一周后，动物的空腹血糖平均值从建模后的20.34mmol/L降到9.8mmol/L，给药三周后，动物的空腹血糖平均值维持在9.9mmol/L，结果表明此复方中药合剂确实能够起到降低高血糖小鼠血<WP=66>糖水平的作用。上述研究表明，构建的小鼠的pmPDX-1载体转染胎肝基质细胞后，能够诱导其向胰腺细胞分化，检测到胰岛素、胰高血糖素、胰多肽的基因表达，同时在分化的过程中，肝细胞的特性并没有完全消失。实验结果表明，可通过向肝细胞中导入