随着全球虾产量的增加,虾加工业迅速发展,虾加工废弃物的产量亦逐年增加,进行合理回收利用,减轻、防止沿海近岸环境污染成为亟待解决问题。应用生物技术实现虾加工废弃物的高附加值、综合回收利用成为今后发展的方向。本研究用食药用真菌以液体发酵的方式转化虾加工废弃物,并用血管紧张素I转换酶(ACE)酶活模型检测了转化产物的抗高血压活性;依次用Plackett-Burman(PB)设计、最陡爬坡实验和响应面设计对转化条件进行了优化;而后用醇沉、大孔树脂吸附、萃取、凝胶柱层析、硅胶薄层层析等方法对有效成分进行了分离纯化;用液质联用法(LC-MS/MS)、气质联用法(GC/MS)对有效成分进行结构鉴定,并以化学合成的方法获得转化产物中丰度较高的两种二肽化合物(Cys-Cys和Cys-Arg)。最后以固相合成法获得了纯化的Cys-Cys和Cys-Arg、验证了二者具有较高ACE抑制活性,并用分子模拟对接的方法探讨了所得ACE抑制二肽抑制的作用机制。主要结果如下:建立了RP-HPLC法检测马尿酸(Hip)产量的色谱条件:流动相乙腈水溶液(30:70,含0.2%的冰醋酸),流速1.0 mL/min的恒度洗脱,检测波长228 nm,柱温30℃。在该色谱条件下,Hip含量检测线性范围广、精密度和重现性好,最低检测限为5 ng,可不经萃取直接检测反应体系中的Hip。确定ACE抑制试验中样品与ACE的作用时间为5 min,反应体系为50μL的反应体系中,ACE和HHL的终浓度分别为50 mU和4.61 mmol/L。18株食药用真菌中,香肉齿菌、乳牛肝菌、粘盖牛肝菌、褐绒盖牛肝菌和鸡油菌于PDA液体培养基中的菌丝生长速度、水提物产量及其水提物ACE抑制活性较高,被用来转化虾加工废弃物,筛选适宜的转化菌株。转化结果表明,转化后褐绒盖牛肝菌菌丝体水提物产量达8.63±0.19 g/L,其ACE抑制IC50值为0.40±0.00 mg/mL(显著低于其他菌株P<0.05或0.01);鸡油菌菌丝体水提物产量达10.72±0.34 g/L,其ACE抑制IC50值为0.84±0.01 mg/mL(显著低于白牛肝菌和粘盖牛肝菌,P<0.05或0.01),是较适宜的虾加工废弃物的转化菌株。故选择褐绒盖牛肝菌和鸡油菌菌株进行转化条件优化。通过PB设计试验发现,料液比、麸面含量、冰醋酸含量为褐绒盖牛肝菌转化虾加工废弃物菌丝体产量的显著影响因素,三者回归系数百分比为92.56%;料液比、冰醋酸含量为褐绒盖牛肝菌转化虾加工废弃物菌丝体水提物ACE抑制活性的显著影响因素,二者回归系数百分比为89.31%。料液比、冰醋酸含量为鸡油菌转化虾加工废弃物菌丝体产量的显著影响因素,二者回归系数百分比为90.22%;料液比、冰醋酸含量为鸡油菌转化虾加工废弃物菌丝体水提物ACE抑制活性的显著影响因素,二者回归系数百分比为93.33%。其中料液比对响应值均为正效应,冰醋酸含量均为负效应。通过响应面设计试验发现,褐绒盖牛肝菌转化虾加工废弃物最优液体发酵条件(兼顾产量与活性)为料液比12.42%,麸面含量7.96%,冰醋酸加入量1.12%;对最优转化条件的验证实验结果与转化条件数学模型预测值差异无显著性(P>0.05),在此条件下菌丝体产量为30.24±0.21 g/L,较优化前提高38.21%;菌丝体水提物ACE抑制IC50为0.21±0.02 mg/m L显著低于优化前(P<0.05)。鸡油菌转化虾加工废弃物最优液体发酵条件(兼顾产量和ACE抑制活性)为料液比11.29%,冰醋酸加入量1.25%;对该转化条件的验证实验结果与发酵条件数学模型预测值差异无显著性(P>0.05),在此条件下菌丝体产量为27.01±1.01 g/L较优化前提高17.63%;菌丝体水提物ACE抑制IC50为0.39±0.07 mg/mL,显著低于优化前(P<0.05)。褐绒盖牛肝菌最优发酵条件下转化虾加工废弃物得菌丝体水提物产量为13.93 g/L,较优化前提高了44.60%;鸡油菌最优发酵条件下转化虾加工废弃物得菌丝体水提物产量为14.25 g/L,较优化前提高了32.95%。在各自的最优转化条件下,无论转化产物的产量还是ACE抑制活性,褐绒盖牛肝菌均优于鸡油菌,因此本研究选取褐绒盖牛肝菌在其最优转化条件下进行大量发酵,以对转化产物中的ACE抑制活性物质进行分离纯化和结构鉴定和活性验证。ACEI分离纯化及结构鉴定结果表明,非极性组分经硅胶薄层层析,得到的活性组分(IC50=0.12±0.00 mg/mL)经GC/MS检测并与标准库匹配,其主要成分有两类,匹配度最高者为邻苯二甲酸二异丁酯、N丙基-2-羟基-1-氧代-1H-氮杂卓、乙酰琥珀酸羟基二丁酯。极性组分经凝胶柱层析后,得到的活性组分为肽类混合物(IC50=0.14±0.00 mg/mL),用LC-MS/MS进行检测,得其中丰度较高的两种分子分别为二肽Cys-Cys和Cys-Arg。对合成的二肽Cys-Cys和Cys-Arg的抗高血压活性验证结果表明Cys-Cys的ACE抑制活性显著高于Cys-Arg,二者的IC50值分别为4.37±0.07μmol/L和475.95±0.11μmol/L。分子对接结果表明,Cys-Cys,Cys-Phe and Cys-Arg均可深入ACE活性中心的腔隙中。其ACE抑制活性的差异可用分子对接的结果解释。ACE与二肽抑制剂间的相互作用方式有氢键、过近接触和二肽的羧基氧与Zn2+间的配位键。本研究以褐绒盖牛肝菌转化虾加工废弃物,首次发现并验证了转化产物中的二肽Cys-Cys和Cys-Arg具有ACE抑制活性,具有作为抗高血压药物的潜在价值,并探讨了Cys-Cys和Cys-Arg的ACE抑制机制。研究结果为实现虾加工废弃物的高附加值充分资源化和研发新型、高效的天然抗高血压药物提供依据。