基于CRISPR/Cas9系统的桔小实蝇transformer基因性别决定研究

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有性生殖是维持种群数量及物种多样性的一个基本的、普遍的过程。在昆虫中,性别决定是产生雌雄二态性最主要的遗传机制之一,是有性生殖的重要过程。在许多昆虫类群中包括双翅目,transformer作为昆虫性别决定的开关,是调节雌雄分化、维持性别特征的关键基因。桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)又名东方果实蝇,是一种威胁果蔬业生产的世界性检疫害虫。在实蝇科中,桔小实蝇的性别决定基因transformer(Bdtra)的结构和功能已经得到分离和鉴定。本研究以非模式生物桔小实蝇为对象,将CRISPR/Cas9系统应用于桔小实蝇的基因组编辑当中,通过胚胎显微注射的方法对桔小实蝇white基因和Bdtra基因进行敲除。主要结果如下:(1)将w1-sgRNA、w2-sgRNA分别与Cas9 mRNA混合注射到桔小实蝇的胚胎可诱导桔小实蝇体细胞系white基因的突变,产生嵌合体表型,其嵌合体的比例分别为5.5%和26.3%;杂交实验获得白眼表型的雌、雄虫后代,表明CRISPR/Cas9系统诱导的white突变能够通过种系遗传传递给下一代。(2)利用CRISPR/Cas9敲除tra基因,在注射tra1、tra2、tra3和共注射tra1+2处理组中,雄虫比达到63%、69.6%、55.3%和74%;且嵌合体表型个体分别占羽化成虫的6.8%、11.6%、2.1%和12%;可育性测试中,tra1、tra2和tra1+2处理组,分别有13.6%,20.1%和20%的雄虫只产生雌性后代,表明这些雄虫为XX假雄虫;间性个体具有雄性栉毛且外生殖器畸形;通过解剖XX假雄虫的精巢发育不完全;而间性个体具有雌、雄两种内生殖器结构;另外,雌虫卵巢发育不完全,不能形成成熟的卵子。本论文成功将CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于桔小实蝇的基因组,实现了对特定基因的定点突变,实验获得的突变体将进一步完善桔小实蝇数据库,提高昆虫不育技术(SIT)的应用范围,同时为桔小实蝇的防治提供理论和技术支撑。
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