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类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种人和动物常见的自身免疫性疾病,容易受到遗传和环境等因素的影响,主要表现为慢性关节滑膜炎,并出现不可逆的关节损伤,最终导致身体残障甚至危及生命。但目前没有治疗RA的特效药。已有研究表明,SIRT1是RA病程变化重要的决定因素,也是研究最深入的乙酰化酶(Sirtuins)家族成员,并且已经被证明与免疫学和内分泌学密切相关,然而其与RA发病机制的详细关系尚不清楚。破骨细胞(Osteoclasts,OCs)由骨髓巨噬细胞分化而来,是体内唯一能够降解骨质的细胞。OCs可以分泌细胞外囊泡与成骨细胞进行信息交流,在维持骨稳态和骨骼生长过程起着关键作用,是RA发病的关键细胞。目前有关OCs对RA作用的研究仅局限于OCs骨吸收功能增强导致关节损伤,然而具体致病机理依然不清晰。在本研究中,我们将对OCs的骨吸收功能增强原因进行探究。胞外陷阱(Extracellular traps,ETs)释放最初被认为是一种用来帮助宿主免受病原体入侵的生理过程,后来发现其与许多其他重要生理和病理过程相关,尤其在多种自身免疫性疾病发挥关键作用。ETs由细胞外DNA(eDNA)结合弹性蛋白酶(Ela)、髓过氧化物酶(MPO)和高迁移率组蛋白B1(HMGB1)等成分组成。一般认为,ETs产生通过两种途径,即NADPH氧化酶(NOX)依赖性方式和NOX非依赖性方式产生,其生成与p-AKT和p-ERK调控有密切联系。多种细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞等)可以分泌ETs,但一直没有关于OCs产生ETs的研究报道。我们于前期RA研究过程中,在国内外首次发现OCs可以产生ETs物质,即破骨细胞胞外陷阱(Osteoclast extracellular traps,OETs)。并发现OETs在RA发病机理中起关键作用,而且还发现SIRT1/p-AKT/p-ERK通路与OETs形成密切相关。因此,在本研究中,为了更全面地探究OETs对RA致病机制,我们将系统探究SIRT1/p-AKT/p-ERK通路介导OETs导致RA发生的机理,为治愈RA提供新的思路。首先,为了明确OCs释放ETs的能力,及ETs形成对OCs破骨能力的影响,我们利用RANKL和M-CSF将小鼠骨髓巨噬细胞体外诱导为OCs,利用荧光酶标仪检测在不同时间点、不同浓度Ⅱ型胶原(CⅡ)或佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)诱导OCs产生eDNA的情况。我们发现,OCs在8μM CⅡ浓度处理6 h时释放eDNA达到峰值(P<0.001);OCs在4μM PMA浓度处理6 h时释放eDNA达到峰值(P<0.001)。然后,我们借助扫描电镜鉴定OETs的形态和结构,使用免疫荧光显微镜确定OETs含有eDNA、Ela、MPO和HMGB1等关键成分。接着,为了探究OCs的骨吸收功能增强原因,我们使用扫描电镜观察骨片的骨吸收陷窝,结果表明OETs的产生能显著增加骨吸收陷窝数,从而增强OCs的骨破坏能力;而HMGB1抗体、DNase I(eDNA抑制剂)和Cl-amidine(组蛋白瓜氨酸化抑制剂)能够有效抑制OCs引起的骨吸收陷窝数并显著降低OCs的骨破坏能力。然后,为了探究OCs释放OETs引起促炎症因子的表达情况,我们使用ELISA检测培养基中TIL-6、IL-1β和TNF-α表达水平。结果表明,CⅡ能够显著诱导TIL-6、IL-1β和TNF-α高表达(P<0.001),而HMGB1抗体、DNase I(eDNA抑制剂)和Cl-amidine(组蛋白瓜氨酸化抑制剂)能够显著抑制炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α(P<0.001)的表达,这表明,OCs产生OETs的过程能够引起TIL-6、IL-1β和TNF-α释放。综上,在体外,PMA和CⅡ均能诱导OCs释放OETs;并提高TIL-6、IL-1β、TNF-α等促炎症因子释放;OETs的产生可以增强OCs对骨组织破坏的能力,而抑制OETs能够有效降低OCs对骨破坏的能力。其次,为了进一步考察SIRT1/p-AKT/p-ERK通路介导CⅡ诱导OETs形成的机制,我们先使用多种抑制剂预处理RANKL和M-CSF诱导小鼠骨髓巨噬细胞来源的OCs,包括Staurosporine(PKC抑制剂)、U0126(ERK和MEK抑制剂)、PD98059(ERK抑制)、DPI(NADPH氧化酶抑制剂)、LY294002(PI3激酶抑制剂和AKT抑制剂)、GW5074(c-Raf抑制剂),并通过激光共聚焦显微镜和荧光酶标仪分析OETs形成情况。结果表明,CⅡ诱导组有明显的OETs产生(P<0.001),ERK抑制剂和AKT抑制剂可以显著降低CⅡ诱导OETs产生(P<0.001),这表明ERK和AKT对OETs的形成有正调控作用;进一步,我们利用Western Blot技术分析ERK和AKT磷酸化和OETs生成的相关性,结果显示,CⅡ可以显著诱导p-ERK和p-AKT高表达(P<0.001),AKT抑制剂显著抑制p-ERK表达(P<0.001),而ERK抑制剂对p-AKT表达无显著抑制作用(P>0.05),这表明在CⅡ诱导OETs形成过程中AKT位于ERK上游。接着,我们通过ZDOCK软件分别考察CⅡ与人及小鼠SIRT1蛋白的互作情况,结果表明,CⅡ分别与人SIRT1蛋白的HIS 363、ARG 274、GLY 415及小鼠SIRT1蛋白的ARG438、ASP 290、GLN 286、TYR 272形成氢键,表明CⅡ能与人及小鼠SIRT1蛋白有较强的结合作用;然后,我们借助CRISPR/Cas9技术构建了SIRT1敲除的破骨前体细胞RAW264.7,并通过Western Blot技术考察了SIRT1、AKT和ERK在CⅡ诱导OETs形成过程中的关系,结果显示,CⅡ诱导可以刺激SIRT1高表达(P<0.001),这与计算机分析的CⅡ强作用于SIRT1结果相一致;Western Blot还表明,敲除SIRT1显著抑制CⅡ诱导p-ERK和p-AKT表达(P<0.001),而ERK和AKT抑制剂对SIRT1表达无显著影响(P>0.001),该结果说明在CⅡ诱导OETs形成过程中SIRT1位于ERK和AKT上游,对p-ERK和p-AKT表达具有调控作用。另外,我们使用荧光酶标仪结合NADPH氧化酶(NOX)抑制剂DPI研究ROS与OETs产生关系,我们发现,与对照组相比,CⅡ诱导组的线粒体ROS含量显著增强(P<0.001),细胞质ROS含量无显著差异(P>0.05),并且DPI预处理后对OETs的释放没有显著抑制(P>0.05),这表明CⅡ诱导OETs产生与NOX无关。综上,体外研究结果表明,CⅡ诱导OCs通过SIRT1/pAKT/p-ERK通路介导OETs产生,并且其生成途径为NOX非依赖性。最后,我们使用CⅡ做诱导剂构建RA小鼠模型,结合三种候选OETs抑制剂(HMGB1抗体、DNase I和Cl-amidine)在体内验证OETs产生机制及考察HMGB1、DNase I和组蛋白瓜氨酸化作为RA治疗靶标的可能性。我们使用ELISA检测RA小鼠血清和关节滑液中的TNF-α和IL-6表达水平;借助免疫荧光技术对RA小鼠关节滑液中OCs、eDNA、Ela、RAGE、MPO、Histone和HMGB1进行共定位;通过HE染色观察RA小鼠关节病理变化和炎症细胞浸润情况;采用Western Blot分析RA小鼠关节滑液中SIRT1/p-AKT/p-ERK通路蛋白表达情况。结果表明,CⅡ诱导构建的RA小鼠模型关节滑液中的OETs是持续产生的,并且伴有IL-6、IL-1β、TNF-α产量增加,同时SIRT1、p-AKT、p-ERK的表达水平显著增强(P<0.001)。持续使用三种OETs抑制剂(HMGB1抗体、DNase I和Clamidine)能够明显改善关节的炎症病理变化并显著降低炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α(P<0.001)表达水平。综上,体内模型结果表明,OETs是RA发生的关键因素;其发生机制由SIRT1/p-AKT/p-ERK通路介导;HMGB1、eDNA和组蛋白瓜氨酸化是治疗RA的潜在靶标,与体外实验结果一致。总之,本研究中我们在国内外首次发现CⅡ能够诱导OETs产生,并明确OETs结构及其组成成分;通过体外实验初步阐明SIRT1/p-AKT/p-ERK通路是介导OETs产生的分子机制;利用CⅡ诱导完成小鼠RA模型构建,并在体内验证SIRT1/p-AKT/p-ERK通路介导的CⅡ诱导OETs产生是RA的发病机制,特别是利用抗体、酶抑制剂和小分子抑制剂的治疗结果发现HMGB1、eDNA和组蛋白瓜氨酸化是治疗RA的潜在靶标。总之,本研究为深入探索RA的发病机制提供了重要理论基础,也为RA防治提供了新靶标。