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目的:本研究采用H2O2建立成骨细胞氧化应激模型,使用芒果苷干预H2O2诱导的成骨细胞,探讨芒果苷对氧化应激状态下成骨细胞增殖分化与骨形成的影响,并研究芒果苷调节H2O2诱导的成骨细胞骨形成减少与自噬凋亡的关系。此外,利用PD98059阻断ERK1/2、FoxO1 siRNA干扰FoxO1转录因子后比较上下游蛋白表达,探究芒果苷对H2O2诱导的成骨细胞保护作用的分子机制。方法:1.氧化应激模型的建立与芒果苷的干预:以成骨细胞为研究对象,使用芒果苷干预,采用H2O2处理,结合MTT法筛选最佳H2O2浓度造成氧化应激模型,筛选适宜芒果苷的浓度作为给药浓度;MTT法检测芒果苷对H2O2诱导的成骨细胞增殖的影响;检测芒果苷对H2O2诱导的成骨细胞内ALP（alkaline phosphatase,碱性磷酸酶）活力及含量的影响。2.芒果苷对氧化应激状态下成骨细胞骨形成的作用:茜素红染色法测定成骨细胞矿化区域;细胞免疫化学法检测成骨细胞OC（osteocalcin,骨钙素）表达;Western Blot检测成骨细胞BMP-2（bone morphogenetic protein,骨形成蛋白）、OPG（osteoprotegerin,骨保护素）、COLⅠ（collagenⅠ,Ⅰ型胶原蛋白）表达;荧光定量PCR检测成骨细胞β-catenin、Runx2、OPG、BMP-2 mRNA表达。3.芒果苷调节H2O2诱导的成骨细胞骨形成减少与自噬凋亡的关系:流式细胞术检测成骨细胞凋亡率;DCFH-DA探针、Fluo-3AM探针分别检测成骨细胞ROS和钙离子含量;Western Blot检测成骨细胞自噬相关蛋白Beclin 1、P62、LC3Ⅱ/Ⅰ和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达。4.芒果苷调控H2O2诱导的成骨细胞骨形成减少的信号通路:芒果苷对ERK1/2阻断条件下H2O2诱导的成骨细胞骨形成的影响。MTT法检测PD98059对成骨细胞的毒性;将成骨细胞分组为正常对照组（Control）,模型组（Model）,PD98059组（PD98059,25μM）,芒果苷组（Mangiferin,80μM）,芒果苷+PD98059组（Mangiferin+PD98059）;Western Blot法检测成骨细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达,确定阻断效率后检测成骨细胞BMP-2、OPG、COLⅠ表达和PTEN、p-PTEN、FoxO1、p-FoxO1表达,荧光定量PCR检测成骨细胞β-catenin、Runx2、OPG、BMP-2 mRNA表达。芒果苷对FoxO1干扰条件下H2O2诱导的成骨细胞骨形成的影响。Western Blot检测Lip2000转染FoxO1 siRNA转染效率;将成骨细胞分组为正常对照组（Control）,模型组（Model）,FoxO1 siRNA组（si FoxO1,10μL）,芒果苷组（Mangiferin,80μM）,芒果苷+FoxO1 siRNA组（Mangiferin+si FoxO1）;Western Blot检测成骨细胞COLⅠ表达和FoxO1、p-FoxO1、ERK1/2、p-ERK1/2、PTEN、p-PTEN、AKT、p-AKT表达,荧光定量PCR检测成骨细胞β-catenin、Runx2、OPG、BMP-2 mRNA表达。结果:1.结果显示,400μM H2O2诱导3h成骨细胞的存活率在70-80%,可作为后续实验氧化应激的造模条件。选择20、40、80μM的芒果苷浓度作为本研究芒果苷的低、中、高干预浓度。芒果苷对H2O2造成的成骨细胞增殖能力降低有改善作用,芒果苷可以增加ALP染色阳性结果,提高氧化应激下成骨细胞内ALP含量,以40μM、80μM组芒果苷效果最为显著。2.芒果苷可以提高氧化应激下的成骨细胞矿化区域和OC表达,上调H2O2诱导成骨细胞BMP-2、OPG、COLⅠ蛋白,不同程度的提高BMP-2、OPG、β-catenin、Runx2 mRNA表达。3.芒果苷显著降低H2O2诱导的成骨细胞凋亡率,减少H2O2诱导成骨细胞内ROS和钙离子含量,芒果苷显著上调H2O2诱导的成骨细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin 1表达,显著下调P62表达。芒果苷显著上调氧化应激下成骨细胞Bcl-2表达,使Bax表达显著降低。4.PD98059能阻断芒果苷上调氧化应激下成骨细胞BMP-2、OPG、COLⅠ蛋白表达,且PD98059会抑制芒果苷增加成骨细胞在H2O2诱导之后BMP-2、OPG、β-catenin、Runx2mRNA表达。信号蛋白检测结果显示,与正常组比较,H2O2会使成骨细胞中的ERK1/2、p-ERK1/2表达显著下降,而PTEN、FoxO1、p-FoxO1表达上调。PD98059是通过降低p-ERK1/2蛋白表达起着阻断作用,并且PD98059抑制芒果苷上调成骨细胞p-ERK1/2表达。PD98059可以加强芒果苷对PTEN、p-PTEN的下调作用但对FoxO1、p-FoxO1蛋白没有明显的影响。5.si FoxO1组会抑制芒果苷上调H2O2诱导下成骨细胞的COLⅠ蛋白和β-catenin、Runx2、OPG mRNA表达,但却显著提高BMP-2 mRNA的表达。说明抑制FoxO1信号后芒果苷对成骨细胞骨形成的保护不是单纯的逆转作用。对信号蛋白表达检测时发现,与模型组比较,成骨细胞在单独给予FoxO1 siRNA干扰之后FoxO1下调,但p-FoxO1上调,AKT增多,p-AKT下调,PTEN下调,而p-PTEN表现出上调的趋势。此外,si FoxO1组对ERK1/2蛋白表达无影响,但可以提高p-ERK1/2蛋白表达。与单独芒果苷干预后比较,芒果苷与FoxO1 siRNA同时干预时,成骨细胞显著降低FoxO1、p-FoxO1的表达,并提高PTEN、p-PTEN、ERK1/2、AKT表达,但对ERK1/2、AKT的磷酸化蛋白表达起抑制作用。结论:1.芒果苷促进氧化应激下成骨细胞的增殖分化。2.芒果苷通过提高成骨细胞矿化、骨形成相关蛋白表达和骨形成相关基因表达实现对氧化应激下成骨细胞骨形成的保护作用。3.芒果苷对氧化应激下成骨细胞起到保护作用的机制之一是减少H2O2诱导的成骨细胞内ROS和钙离子含量。4.芒果苷增加成骨细胞受到氧化应激时的自噬且减少成骨细胞凋亡发挥其对H2O2诱导的成骨细胞骨形成的保护作用。5.芒果苷改善氧化应激下成骨细胞骨形成作用与其调控PTEN/AKT/ERK/FoxO1信号通路密切相关。