第一部分、miR-17/20a调控TGF-β通路抑制食管癌浸润转移的机制研究　　作为非编码小RNA分子，microRNA能够通过对靶基因的直接影响从而调控肿瘤进程，其在肿瘤浸润转移中的功能和作用越来越受到人们的关注。本实验室前期通过chemotaxis模型筛选，得到了运动能力存在显著差异的4种食管癌细胞亚型，即30-U/D和180-U/D。对它们进行microRNA芯片分析后，我们发现miR-17和miR-20a在运动能力较弱的“U”细胞亚群中高表达，提示二者可能与食管癌的运动相关。miR-17/20a属于miR-17-92癌基因簇，许多研究报道了二者在多种类型肿瘤进展中的作用，但在食管癌中却鲜有报道。本研究旨在探究miR-17/20a在食管癌中的功能及调控机制。　　首先，我们利用RT-qPCR实验进行了microRNA芯片结果验证。与30-D和180-D相比，miR-17/20a在30-U和180-U中的表达较高。通过后续的体外功能实验，我们发现miR-17/20a能够显著抑制食管癌细胞的运动和浸润能力，对细胞增殖和细胞凋亡的作用则比较微弱。通过数据库预测，我们得到了多个miR-17/20a的潜在下游靶基因。Luciferase reporter，Western Blotting及tranwell功能实验结果表明TGFBR2和SARA是miR-17/20a的功能性靶基因，能够影响食管癌细胞的运动和浸润能力。研究表明TGFBR2和SARA均参与到TGF-β通路之中。由于功能的复杂性和灵活性，TGF-β通路既可以发挥抑癌的作用，又可以促进肿瘤的浸润转移。本实验室前期已证实TGF-β能够促进食管癌细胞的运动，因此我们进一步探究miR-17/20a能否影响TGF-β通路的活化。在30-D细胞中，高表达miR-17/20a能够显著抑制Smad2的磷酸化，而在180-U细胞中敲降miR-17/20a后，Smad的磷酸化水平显著升高。Smad2作为核心组分，其磷酸化水平直接反映了TGF-β通路的活性。在加入TGF-β1后，30-D细胞的运动能力显著增加。以上结果表明miR-17/20a能够抑制TGF-β通路从而削弱了食管癌细胞的运动和浸润能力。　　在体内肺转移模型中，我们发现miR-17/20a抑制了食管癌细胞发生肺阻滞，这反映了二者对食管癌浸润转移的抑制作用。根据临床组织标本检测结果及GEO数据库信息，我们发现TGFBR2和SARA在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达并无显著差异。　　综上所述，本研究首次发现miR-17/20a能够抑制食管癌细胞的运动和浸润能力，且对细胞增殖和凋亡无显著影响。作为miR-17/20a的功能性靶基因，TGFBR2和SARA能够影响食管癌细胞的运动和浸润，但在癌和癌旁组织中表达无显著差异。miR-17/20a能够通过抑制TGF-β通路从而发挥对食管癌细胞运动和浸润的抑制作用。本研究加深了我们对miR-17/20a在食管癌浸润转移中作用的认识，阐明了miR-17/20a在食管癌中的调控机制，为食管癌的临床治疗和药物开发提供了新的思路和理论依据。　　第二部分、miR-92b调控ITGAV抑制食管癌浸润转移的机制研究　　Integrin蛋白是一种胞外基质的跨膜粘附受体，不仅能够介导细胞与胞外基质的粘附，还可以调节胞内信号通路从而影响相关生物学进程，对肿瘤细胞的运动和浸润十分重要。Integrin家族共有26个成员，其中包括18种α亚基和8种β亚基，它们以异二聚体的形式发挥功能。本实验前期研究发现miR-92b能够直接作用于ITGA6并抑制其表达，从而削弱了食管癌细胞的运动和浸润能力。而通过数据库分析，我们发现ITGAV也可能是miR-92b的下游靶基因，为此我们在食管癌中进行了相关研究来探究二者之间的相互作用关系及对食管癌浸润转移的影响。　　首先，我们选取了3种运动能力存在显著差异的食管癌细胞(30-D，KYSE450和KYSE510)，通过RT-qPCR实验分别检测了miR-92b和ITGAV的表达情况，发现二者呈负相关关系，且随着细胞运动能力的减弱，ITGAV的表达也随之下降。瞬时过表达或敲降实验结果表明miR-92b能够调控ITGAV的表达水平，结合后续的Luciferase reporter及transwell功能实验，确认ITGAV是miR-92b的功能性靶基因，能够影响食管癌细胞的运动和浸润能力。　　随后，我们对miR-92b参与浸润转移的分子机制进行了探究。经过chemotaxis模型处理后，miR-92b过表达的30-D细胞中，FAK通路受到显著抑制，并且下游分子Rac1的活性也显著下降。同样的结果在ITGAV被敲降后也被观察到。另外，加入Rac1抑制剂NSC23766后，30-D细胞的运动能力显著下降。以上结果表明miR-92b通过调控ITGAV-FAK-Rac1信号通路从而发挥了对食管癌细胞运动和浸润的抑制作用。　　在体内肺转移模型中，我们发现miR-92b能够通过抑制ITGAV从而减弱了食管癌细胞发生肺阻滞，且ITGAV并未对食管癌细胞的体内增殖产生显著影响，反映了二者对食管癌浸润转移的相关作用。根据临床组织标本检测结果及GEO数据库信息，我们发现ITGAV在食管癌组织中高表达且与淋巴结转移正相关。值得注意的是，本实验室前期结果显示miR-92b与食管癌淋巴结转移负相关，这也体现了miR-92b通过负调控ITGAV的表达来抑制食管癌细胞的浸润转移。　　综上所述，本研究结果表明，敲降ITGAV能够抑制食管癌细胞的运动和浸润且并不影响增殖，ITGAV为miR-92b的功能性下游靶基因，miR-92b通过调控ITGAV-FAK-Rac1信号通路来发挥对食管癌细胞运动和浸润的抑制作用。在食管癌组织中ITGAV高表达，且与淋巴结转移正相关。本研究加深了我们对miR-92b及ITGAV在食管癌浸润转移中作用的认识，阐明了miR-92b对ITGAV的调控机制，也为miR-92b/ITGAV能否进入临床治疗实践，或作为食管癌患者淋巴结转移的诊断指标提供了理论依据。