光修复酶是一类可以直接修复紫外线造成的DNA损伤的蛋白。根据作用底物的不同,光修复酶可以分为CPD光修复酶和6-4光修复酶两大类,分别可以修复两种主要的DNA紫外损伤,即环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光产物。光修复酶可吸收315-500 nm波长范围的光,并以此为能量催化修复DNA上的紫外损伤,恢复DNA的正常结构。而隐色素是一类光修复酶的同源蛋白,但不具有修复DNA损伤的能力。隐色素一般通过与其它蛋白的相互作用来调控基因的表达。植物隐色素参与调控植物的生长发育和光形态建成,还可能参与植物昼夜节律的校准。动物隐色素则主要维持动物昼夜节律,即在生物钟方面起作用。尽管光修复酶和隐色素功能差别很大,但它们之间的序列同源性很高,空间结构相似,都可以结合FAD辅酶,而且可能通过类似的光反应机制发挥功能,因此将它们总称为隐色素/光修复酶蛋白家族(CPF)。我们首先研究了大肠杆菌光修复酶在体内、体外的蛋白性质。结果显示,当培养温度≥37°C时,大肠杆菌体内的光修复酶活性会显著下降,同时光修复酶的表达水平也显著降低,但光修复酶基因phr的转录水平并未发生明显的变化。通过lacZ报告基因的融合表达实验也证明,与phr基因转录融合的lacZ报告基因的表达基本不随培养温度而变化,但翻译融合的phr基因和lacZ报告基因所表达的光修复酶-LacZ融合蛋白,其半乳糖苷酶活性则随培养温度的上升而下降,说明,在较高培养温度条件下,大肠杆菌光修复酶的活性受转录后水平的调控。我们对体外光修复酶的蛋白酶降解性质作了检测,结果发现光修复酶,尤其是其脱辅酶蛋白,含有较多的蛋白酶敏感位点,易于被蛋白酶降解。体外实验还表明,光修复酶的热稳定性较差,其中具有还原型FAD辅酶活性的光修复酶在37°C以上开始变性,而脱辅酶蛋白在25°C以上就开始变性。培养温度的转换实验表明,在体内光修复酶相对稳定,不易热变性以及不易被蛋白酶降解;而新合成的脱辅酶蛋白则较不稳定,容易变性,并受蛋白酶的降解。综合以上实验结果,我们认为新合成的脱辅酶蛋白在较高培养温度下发生热变性并被蛋白酶降解,是导致大肠杆菌体内光修复酶活性下降的根本原因。此发现在紫外消毒的应用中具有一定意义,即在不同环境温度下需要使用不同的紫外剂量达到相同的消毒效果。此外,在本研究中发现大肠杆菌光修复酶是一种热不稳定的蛋白,这种热不稳定性可能是适应环境的结果,具有一定的进化意义。大肠杆菌等光修复酶的热不稳定性,还可能作为“原型”进化出某些具有光不稳定性的隐色素。我们对现有的全基因组和转录组数据库中的CPF家族蛋白序列作了系统发生分析。结果表明,CPF可分为CPD I型光修复酶相关蛋白、CPD II型光修复酶以及FeS-BCP三大进化分支。其中CPD II型光修复酶常见于古菌和真核生物;而FeS-BCP是最近发现的一种CPF家族蛋白,大部分成员都含有铁硫中心,可能是原核6-4光修复酶,据推测可能是CPF家族中较古老的祖先。CPD I型光修复酶又可分为CPD I/CPD III/植物隐色素、DASH/6-4光修复酶/动物隐色素/GIHY,以及SPL/MPL蛋白三个亚支。其中CPD I/CPD III/植物隐色素亚支包括CPD I型光修复酶和CPD III型光修复酶,而植物隐色素包含在CPD III型光修复酶分支之中。DASH/6-4光修复酶/动物隐色素/GIHY亚支包括DASH蛋白、6-4光修复酶和GIHY蛋白。DASH蛋白可能是一种单链特异的CPD光修复酶。6-4光修复酶主要存在于真核生物,而动物隐色素包含在此分支中。GIHY蛋白是本研究中发现的新蛋白,可能是一种原核隐色素。SPL/MPL蛋白也是在本研究中新发现的CPF家族成员,可能是一种CPD光修复酶,但其序列长度较短(200~400aa),缺少大部分光修复酶和隐色素蛋白N端的同源序列。而且部分SPL/MPL蛋白中也含有铁硫中心,因此SPL/MPL可能是一种古老的蛋白,甚至可能是整个CPF家族的祖先。系统发生分析显示,位于辅酶FAD异咯嗪环的嘧啶环上方的氨基酸残基(大肠杆菌光修复酶中为A377)在光修复酶和隐色素中的分布有明显的区别。在CPD I、CPD III、DASH、SPL/MPL、CPD II等可能以CPD为底物的蛋白中,该位点出现A、S、N等残基的频率较高;而在6-4光修复酶、FeS-BCP等可能以6-4光产物为底物的蛋白、动物隐色素以及未知功能的GIHY蛋白中,出现I,L,V等残基的频率较高;在植物隐色素中,大部分蛋白出现的是S,有小部分出现C。为阐明该位点可能的功能,我们以大肠杆菌光修复酶为基础,将A377突变为S、N、I、L、V、C等残基,然后对突变蛋白的催化活性、光谱性质、光照稳定性、氧化稳定性等性质作了研究和分析。结果表明,突变蛋白和野生型酶的活性没有明显差别,说明A377不影响CPD损伤的修复。A377S和A377N的光吸收峰相对野生型酶略有蓝移,在光照下更稳定,且减慢了其在空气中的氧化速率;而A377I、A377V、A377C等突变蛋白的光吸收峰则出现红移,在光照下FAD辅酶会出现脱落,且在空气中的氧化速率加快。这说明A377突变为I、V、C等隐色素中常见的残基后,大肠杆菌光修复酶变为光照不稳定,具有了某些类似隐色素的性质。因此,A377残基的变化可能是光修复酶向隐色素进化的重要中间环节。