目的:骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤,预后极差,发现时常常已经发生肺转移。转录共激活因子4(PC4)在DNA转录、复制、修复、染色体构成等过程中发挥了复杂且重要的作用。目前有相关研究提示PC4可能与肿瘤有一定联系,但是其具体机制尚不明确,尤其是在骨肉瘤的研究领域中,PC4的具体作用尚无人报道。本研究目的在于探索PC4对骨肉瘤恶性表型的影响及其可能的分子机制。首先,在前期研究基础上探索PC4蛋白表达量与临床骨肉瘤分期、预后的联系。然后,在多种不同恶性程度的骨肉瘤细胞模型中检测PC4的表达情况。在高肺转移骨肉瘤细胞株143B中使用慢病毒干扰PC4的表达,检测恶性表型的变化,分析PC4可能参与哪些恶性表型的调控。通过RNA-seq的高通量测序法,分析143B细胞株在干扰PC4后基因表达的变化情况,分析可能存在的PC4下游靶基因,并与表型实验结合,分析哪些靶基因参与了PC4对骨肉瘤恶性表型的调控。针对骨肉瘤肺转移表型,通过筛选分析RNA-seq结果,剖析PC4对MMP9的具体调控机制。针对骨肉瘤骨破坏表型,通过筛选分析RNA-seq结果,剖析PC4参与骨肉瘤骨破坏的具体分子机制及可能存在的靶基因。方法:1.PC4蛋白表达量与临床骨肉瘤分期、预后的联系。1.1使用免疫组织化学法分析198例骨肉瘤临床标本和44例正常骨组织中PC4的表达量与年龄、性别、Enneking分期、肿瘤大小之间的关系,并对免疫组化结果进行量化评估。1.2使用WB法分析5例骨肉瘤临床标本和对应正常癌旁组织中PC4的表达量,分析PC4在骨肉瘤组织和正常组织中存在差异表达。1.3随访59例骨肉瘤病例,分析PC4的表达情况与患者生存时间之间的关系,绘制生存曲线。2.通过细胞模型和裸鼠荷瘤实验,在多种不同恶性程度的骨肉瘤细胞株中检测PC4的表达情况。分析PC4可能参与的骨肉瘤恶性表型调控。2.1分析PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的蛋白表达情况。2.1.1免疫荧光法检测PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的表达量及细胞定位情况。2.1.2 WB法检测PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的表达量。2.2双层软琼脂克隆实验检测7种骨肉瘤细胞的基础克隆形成能力。2.3裸鼠荷瘤实验检测多种骨肉瘤细胞的成瘤能力。2.4使用RT-PCR法在多种骨肉瘤细胞株中检测恶性表型相关基因的表达情况。2.5在143B高肺转移骨肉瘤细胞株中使用慢病毒干扰PC4的表达。2.5.1人PC4干扰慢病毒的构建。2.5.2免疫荧光法检测PC4慢病毒干扰效率,有限稀释法挑选高转染效率的亚细胞克隆。2.5.3使用WB法检测PC4慢病毒干扰效率。2.5.4使用CCK-8法检测PC4干扰前后143B细胞增殖能力的变化。2.5.5使用流式细胞仪检测PC4干扰前后143B细胞周期的变化。2.5.6使用双层软琼脂克隆法检测PC4干扰前后143B细胞集落形成能力的变化。2.5.7使用划痕实验检测PC4干扰前后143B细胞迁移能力的变化。2.5.8使用Transwell检测PC4干扰前后143B细胞侵袭能力的变化。2.5.9使用CCK-8法检测PC4干扰前后143B细胞粘附能力的变化。2.5.10裸鼠荷瘤实验检测PC4干扰前后143B细胞成瘤能力及肺转移能力的变化。3.使用RNA-seq的高通量测序法,分析143B细胞株在干扰PC4后基因表达的变化情况。3.1分析143B细胞株在干扰PC4后存在差异表达的基因。3.2使用Gene ontology分析差异表达基因在不同细胞功能、细胞组成、生物学功能中的富集程度,探寻差异表达基因可能的效应。3.3使用KEGG pathway分析差异表达基因在不同信号通路中的富集程度,探寻差异表达基因可能的参与的信号通路。4.针对骨肉瘤肺转移表型,基于RNA-seq结果,剖析PC4参与MMP9的调控进而影响骨肉瘤肺转移能力的机制。4.1使用PC4干扰慢病毒在7种骨肉瘤细胞株中验证慢病毒干扰效率;RT-PCR法检测7种骨肉瘤细胞株在PC4干扰后MMP-2、MMP-9、FN基因RNA水平的变化情况。4.2使用外源性人重组FN蛋白和FNsi RNA分别在143B和MG63两种细胞模型中验证FN对MMP-2和MMP-9的调控作用。4.3使用染色质免疫共沉淀法分析PC4与MMP-9启动子区域的结合能力。4.4使用荧光素梅报告基因和PC4si RNA及SP1si RNA,检测PC4和SP1对MMP-9基因转录激活能力。4.5免疫共沉淀法分析143B细胞中PC4蛋白与SP1蛋白的结合能力。5.针对骨肉瘤骨破坏表型,基于对RNA-seq结果的分析,剖析PC4参与骨肉瘤骨破坏的具体分子机制及可能存在的靶基因。5.1裸鼠荷瘤实验检测PC4干扰前后143B细胞对骨破坏的影响。5.1.1 Micro CT检测病理性骨折的发生率、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨量的变化。5.1.2分别在共培养细胞模型和条件培养基细胞模型中检测PC4干扰143B细胞对RAW264.7破骨分化的影响。使用TRAP染色和骨片扫描电镜评估破骨细胞成熟程度。5.1.3分析RNA-seq结果,筛选与破骨细胞活化相关的分泌型细胞因子,并使用RT-PCR法验证RNA-seq结果。5.1.4使用WB法验证IGFBP5在PC4干扰前后的蛋白表达情况。5.1.5使用外源性IGFBP5蛋白,检测其对RAW264.7破骨分化的影响,使用TRAP染色评估破骨细胞成熟程度。5.1.6使用外源性IGFBP5蛋白,在条件培养基细胞模型中检测PC4干扰及外源性IGFBP5对RAW264.7破骨分化的影响,使用TRAP染色评估破骨细胞成熟程度。结果:1.PC4蛋白表达量与临床骨肉瘤分级、分期、预后的联系。1.1 PC4主要在细胞核表达,在高分期的骨肉瘤标本中表达较高,PC4的表达与骨肉瘤的患者的性别、年龄无关,与肿瘤的大小以及肿瘤的Ennenking分期相关。1.2 WB法检测结果提示PC4在骨肉瘤组织和配对的正常组织中存在差异表达,在骨肉瘤组织中高表达。1.3随访59例骨肉瘤病例,生存曲线分析结果提示:PC4的阳性率与患者生存时间负相关。2.通过细胞模型和裸鼠荷瘤实验,在多种不同恶性程度的骨肉瘤细胞株中检测PC4的表达情况。PC4参与多种骨肉瘤恶性表型调控。2.1 PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的蛋白表达情况。2.1.1免疫荧光法检测PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的表达量及细胞定位情况:PC4在7中骨肉瘤细胞株中均有表达,主要表达与细胞核,胞浆有少量表达。表达强度由强到弱依次为:143B、MNNG-HOS、9901、MG-63、U2OS、HOS、SAOS2。2.1.2 WB法检测PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的表达量:PC4在7中骨肉瘤细胞株中均有表达,表达强度由强到弱依次为:143B、MNNG-HOS、MG-63、U2OS、9901、HOS、SAOS2。2.2双层软琼脂克隆实验检测7种骨肉瘤细胞的基础克隆形成能力:克隆形成能力由强到弱依次为:143B、MNNG-HOS、MG-63、9901、HOS、SAOS2、U2OS。2.3裸鼠荷瘤实验检测多种骨肉瘤细胞的成瘤能力:,143B和MNNG-HOS拥有最强的成瘤能力,9901次之,MG-63较弱,HOS在观察期内未成瘤。2.4使用RT-PCR法在多种骨肉瘤细胞株中检测恶性表型相关基因的表达情况:PC4在143B、MNNG-HOS、U2OS表达较高,HOS表达最弱;而MMP9在143B中表达异常增高,其余骨肉瘤细胞株中表达相对弱。143B的MTA1表达最高,MNNG-HOS次之,其余细胞株表达较弱。143B中P53几乎测不到表达,而HOS和U2OS相对表达最高。2.5在143B高肺转移骨肉瘤细胞株中使用慢病毒干扰PC4的表达。2.5.1人PC4干扰慢病毒的构建。2.5.1免疫荧光法结果提示PC4慢病毒转染率约90%;有限稀释法挑选高转染效率的亚细胞克隆并成功扩增。2.5.2 WB法检测PC4慢病毒干扰效率约为70%,且多次传代后干扰效率无明显下降。2.5.3 CCK-8法检测结果提示:PC4干扰后143B细胞增殖能力有一定程度的下降。2.5.4流式细胞仪检测结果提示:PC4干扰后143B细胞周期出现G1期阻滞。2.5.5双层软琼脂克隆法检测结果提示:PC4干扰后143B细胞集落形成能力的明显下降。2.5.6划痕实验检测结果提示:PC4干扰后143B细胞迁移能力下调。2.5.7 Transwell检测结果提示:PC4干扰后143B细胞侵袭能力下调。2.5.8 CCK-8法检测结果提示:PC4干扰后143B细胞粘附能力明显下降。2.5.9裸鼠荷瘤实验检测结果提示:PC4干扰后143B细胞成瘤能力及肺转移能力均出现明显下降。3.RNA-seq的高通量测序法,分析143B细胞株在干扰PC4后基因表达的变化情况。3.1在143B细胞株中干扰PC4后,513个基因出现下调,571个基因上调。3.2 Gene ontology分析结果提示:PC4干扰后的差异表达基因可能参与了蛋白粘附、细胞连接、细胞外基质的分泌、细胞运动、细胞应激等多种细胞生物学功能的调节。3.3 KEGG pathway分析结果提示:PC4干扰后的差异表达基因在p53等20条信号通路中呈现富集状态。4.PC4参与MMP9的调控进而影响骨肉瘤肺转移能力。4.1 PC4干扰慢病毒在7种骨肉瘤细胞株中均有干扰效果;PC4干扰后MMP-2、MMP-9、FN基因RNA水平除个别细胞株外均有不同程度的下调。4.2外源性人重组FN蛋白和FNsi RNA对MG63细胞的MMP-2和MMP-9均有明显调控作用,但是对143B和143BPC4-4.3染色质免疫共沉淀法结果提示:PC4蛋白可以与MMP-9启动子区域结合。细胞的MMP-2和MMP-9没有明显的调控作用。4.4荧光素梅报告基因结果提示:PC4si RNA及SP1si RNA均可降低MMP-9的转录活性,二者存在协同效应。4.5免疫共沉淀法结果提示:143B细胞中PC4蛋白与SP1蛋白可以结合。5.PC4参与骨肉瘤骨破坏的具体分子机制及可能存在的靶基因。5.1裸鼠荷瘤实验检测PC4干扰前后143B细胞对骨破坏的影响。5.1.1 Micro CT检测结果提示:PC4干扰组的裸鼠病理性骨折的发生率明显降低、骨小梁数量增加、骨小梁厚度增厚、骨量增加。5.1.2共培养细胞模型和条件培养基细胞模型均提示:骨肉瘤细胞可以促进RAW264.7的破骨分化,PC4干扰可抑制该效应。5.1.3 RNA-seq结果提示:在PC4干扰后CXCL2、IGFBP5、MCP1、IL1A、IL1B明显下调,RT-PCR法验证结果与RNA-seq结果一致。5.1.4 WB法检测IGFBP5在PC4干扰后的蛋白表达明显下调。5.1.5外源性IGFBP5蛋白,可增加TRAP阳性细胞的数量,且该效应呈浓度依赖性。5.1.6外源性IGFBP5蛋白在条件培养基细胞模型中,可部分抵消PC4干扰对RAW264.7破骨分化的抑制作用。结论:1.PC4在骨肉瘤中高表达;2.PC4与骨肉瘤的分期及预后存在相关性;3.PC4参与调控骨肉瘤的增殖、侵袭、迁移、粘附、集落形成、成瘤、转移等恶性表型;4.PC4通过与MMP9的转移因子SP1形成转录复合体,参与MMP9的转录调控;5.PC4的表达量与143B细胞引起的骨吸收正相关;6.干扰在143B骨肉瘤细胞中PC4的表达,可抑制143B分泌CXCL2、CCL2、IGFBP5、IL1A、IL1B,从而抑制破骨细胞的激活,降低骨肉瘤引起的骨破坏。