经典Wnt信号转导途径(Wnt/β-catenin信号转导途径)是在多细胞真核生物中(从线虫、果蝇到小鼠、人)高度保守的一条信号途径，在生物体的生长发育过程中起着重要的作用。Wnt信号诱导的细胞分化和极化过程参与影响了早期胚胎发育过程中的多个重要的生理过程，Wnt信号紊乱或信号途径中信号转导分子的突变可引起生物体的发育缺陷，也可导致多种疾病的发生；而Wnt信号与其他信号途径间的相互作用更使其功能几乎影响到生物体发育过程中的各个方面。因此，Wnt信号途径已经成为近年来国际上生物学研究的一个热点。但是，由于Wnt途径本身调控的复杂性和功能的多样性，人们对Wnt信号途径和网络的认识仍然有待进一步深入：首先，Wnt信号途径中信号转导的分子机制仍没有完全阐明；其次，由Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+、Wnt/JNK等分支构成的wm信号网络，因为其功能的多样性，可以预测还有许多参与Wnt信号调节的因子有待发现。本工作旨在寻找到更多的参与调节经典的或非经典的Wnt信号途径的分子，一方面丰富关于Wnt信号途径本身调节的认识，一方面扩展Wnt信号与其他信号途径之间的联系，深入理解Wnt信号功能的多样性。 第一部分针对Wnt信号途径中的关键分子Dishevelled(Dvl)蛋白为靶点，结合SILAC技术，分离Dvl在静息状态下的复合物成分，试图发现可能与Dvl相互作用的蛋白质，从而发现Dvl的新功能或者揭示Wnt信号调节的新机制。我们首先建立了HA-Dvl稳定细胞株，经过抗体检测，筛选与内源水平相当的株系，结合SILAC方法，通过免疫沉淀分离并进一步通过质谱分析了Dvl为靶点的内源复合物成分。我们初步的实验结果鉴定出了60多个可能的蛋白质成分，其中有2个是已有文献报道能与Dvl相互作用，还有10个与我们实验室以前酵母双杂交筛选的结果一致，其中一个是NF-κB信号途径的中心分子p65。首先，我们通过在哺乳细胞中过表达外源的Dvl和p65发现它们可以被免疫共沉淀，而且在大肠杆菌中表达纯化的Dvl的C端片段能与p65的N端片段有相互作用，从而确认了它们存在直接的相互作用。接着，我们探索这个相互作用的功能，发现Dvl蛋白对TNFα及过表达p65引起的NF-κB报告基因活性有抑制作用，而且这种抑制是不依赖于Dvl参与的Wnt/β-catenin信号途径及JNK活性的；进一步用RNA干扰技术下调内源Dvl时，TNFα介导的NF-κB的活性有激活，表明Dvl蛋白确实是NF-κB途径中的一个新的负调节因子。为了探索这种抑制作用的机制，我们检测了TNFα诱导的IκBα的降解以及p65的入核，发现这两种现象都不受过表达Dvl的影响，表明Dvl影响的是p65下游的事件。我们在实验中发现，过表达的和内源的Dvl在核里都有存在，进一步免疫共沉淀实验表明，尽管p65和Dvl在胞浆中的量较它们在细胞核内的量高得多，过表达的或者内源的Dvl-3与内源的p65的相互作用只发生在核里，而且是在TNFα刺激下才发生。在进一步研究Dvl作用的分子机制过程中，我们发现Dvl可以抑制p65对某些靶基因promoter区的结合，从而调节这些靶基因的活性。进一步的凋亡实验也表明Dvl的确能对NF-κB活性产生抑制，从而促进TNFα引起的细胞凋亡。上述工作揭示了Dvl可以在Wnt信号途径以外发挥新的功能，这种新功能是在细胞核里发生的，能通过影响p65对某些基因的结合调节NF-κB信号的活性。由于NF-κB信号途径在癌症、免疫、炎症方面的重要作用，Dvl这一新功能的发现，无论是对加深相关机理的认识还是对相关疾病的防治都应该有重要意义。 第二部分从磷酸化蛋白质组入手，从蛋白质磷酸化调节的角度研究Wnt信号途径及其网络，期望发现Wnt信号途径可能存在的其他磷酸化调节靶点。我们通过SILAC技术在293细胞中标记了两种稳定同位素的赖氨酸，然后用纯化的Wnt-3a刺激0，1分钟和30分钟，接着应用IMAC分离纯化细胞内所有的磷酸化蛋白质，最后通过LC-MS/MS(液相色谱一二维质谱)鉴定，结合SILAC定量，寻找Wnt信号刺激前后发生变化的磷酸化蛋白质。质谱结果表明在三个时间点中都有的蛋白质有1057种，其中有11种是文献报道与Wnt信号途径有关的，在1057种蛋白质中有287种与不刺激相比发生了大于1.5倍的增减变化，我们针对这287种有变化的蛋白质进行了深入分析，针对一些磷酸化变化比较明显的新蛋白质深入研究与Wnt/β-catenin信号途径的关系，发现RRM2(Ribonucleoside-diphosphate reductase M2 subunit)Ser20位点的磷酸化在Wnt刺激30分钟时发生了约1.5倍的变化，表明这个蛋白可能受Wnt信号的调节。我们进一步研究RRM2与Wnt信号途径的关系，发现过表达RRM2能抑制Wnt信号的活性，但并不影响游离的β-catenin的稳定性：而且，RRM2对TNFα介导的NF-κB活性没有影响。这些结果表明RRM2对Wnt信号的作用是特异的，而且作用在β-catenin的下游。用siRNA下调内源RRM2会上调本底和△N-β-catenin的活性而对Wnt-3a的活性没有显著影响。进一步发现把Ser20突变成Ala后的RRM2对Wnt信号的抑制更强，而突变成Glu则抑制程度减弱。上述结果表明RRM2可能是β-catenin下游的一个内在的抑制蛋白，Wnt信号刺激可导致其Ser20位点磷酸化修饰，从而解除其对β-catenin下游的转录抑制作用。综上所述，通过蛋白质组学的思路技术全面分析经典Wnt信号途径中的所有磷酸化蛋白质，为我们发现未知信号调节分子及已知或未知信号转导分子发挥作用的分子机制提供重要线索，有助于我们加深认识Wnt信号及其网络的分子机制的认识。 本论文结合蛋白质组学的技术方法，通过研究了Dvl为核心的蛋白质复合物，发现了Dvl在Wnt信号途径以外的新功能，能在核里对NF-κB活性产生抑制。由于NF-κB信号途径在癌症、免疫、炎症方面的重要作用，对Dvl这一新功能的发现，有可能对相关疾病的治疗产生重要的意义。本论文还应用蛋白质组学方法研究Wnt-3a刺激下的磷酸化蛋白质的变化并发现了Wnt信号途径中的新的调节分子，表明研究研究细胞内在各种信号刺激或病理生理变化过程中蛋白质修饰的动态变化，是切实可行的。这一研究思路在未来的生物学研究中具有非常广阔的应用前景，为进一步的研究工作提供了全新的认知视角及研究手段。