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目的:隐孢子虫是引起人类腹泻的重要病原体,严重威胁婴幼儿及免疫功能缺陷患者生命,尚无有效地治疗方法,开展隐孢子虫诊断技术和治疗药物研究对于防治隐孢子虫病具有重要意义。本研究建立PCR-RFLP技术和基因测序技术用于鉴定隐孢子虫虫种;建立经济高效的隐孢子虫卵囊基因组DNA纯化方法用于PCR检测;建立安氏隐孢子虫细胞模型,用于抗隐孢子虫药物的筛选。方法:根据隐孢子虫SSU rRNA基因序列设计引物,Nest-PCR技术扩增来源于牛、小鼠和大鼠的3株隐孢子虫SSU rRNA序列,RFLP技术和基因测序技术鉴定虫种。在隐孢子虫卵囊悬液中分别加入进口试剂盒和国产试剂盒的裂解液以及2%Triton X-100和5%异硫氰酸胍,辅以不同组合方式使用的冻融法、蛋白酶K法和声裂法裂解卵囊,通过Real-time PCR法测定裂解产物中隐孢子虫卵囊囊壁蛋白(Cryptosporidium oocyst wall protein,COWP)基因拷贝数。安氏隐孢子虫卵囊感染人结肠癌(HCT-8)细胞,Real-time PCR技术测定RPMI-1640培养液中分别加入不同浓度胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、葡萄糖(glucose,GLU)、维生素C(ascorbic acid,ASC)、叶酸(folic acid,FOLIC)、泛酸钙(calcium pantothenate,CAPAN)和胰岛素(insulin,INSULIN)后虫体的增殖效果。Giemsa染色观察虫体的增殖,透射电镜观察虫体发育形态。MTT法测定硝唑尼特(nitazoxanid,NTZ)和银杏酸(ginkgoic acid,GAs)对HCT-8细胞安全浓度。Real-time PCR技术测定不同浓度NTZ和GAs作用后COWP基因拷贝数,透射电镜观察NTZ和GAs对虫体生长的影响。结果:PCR-RFLP技术与基因测序技术鉴定牛源、小鼠源和大鼠源隐孢子虫分别为安氏隐孢子虫(Cryptosopridium andersoni)、隐孢虫小鼠型(Cryptosporidium mousegenotype)和隐孢子虫大鼠型(Cryptosporidium rat genotype)。进口试剂盒的裂解液裂解隐孢子虫卵囊效果最好,纯化所得卵囊COWP基因拷贝数可达(6.450～9.861)×10~6个;其次为国产试剂盒的裂解液,卵囊COWP基因拷贝数(2.377～3.689)×10~6个;再次为5%异硫氰酸胍,COWP基因拷贝数为(1.272～21.29)×10~5个;而2%Triton X-100的裂解效果最差,COWP基因拷贝数仅为(2.060～866.7)×10~3个。冻融法+蛋白酶K法+声裂法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果最佳,其次为冻融法+声裂法和蛋白酶K法+声裂法,冻融法+蛋白酶K法效果最差。10%FCS是培养安氏隐孢子虫的最佳FCS浓度,葡萄糖、维生素C和胰岛素都具有促安氏隐孢子虫增殖作用,泛酸钙无促虫体增殖效果,而叶酸则抑制虫体增殖。10%FCS RPMI-1640培养液中加入50 mmol/L葡萄糖,50μg/ml维生素C和0.3 U/ml胰岛素促安氏隐孢子虫增殖效果最显著,虫体增殖8倍。Giemsa染色也支持上述结果。透射电镜在HCT-8细胞中观察到安氏隐孢子虫的滋养体、雌配子体、雄配子体、Ⅰ型裂殖体、Ⅱ型裂殖体和子孢子阶段。1.25μg/ml NTZ和0.31μg/ml GAs即可显著抑制HCT-8细胞中安氏隐孢子虫的增殖。20μg/ml NTZ和5μg/ml GAs作用后,虫体数量仅分别为未加药的0.29%和0.66%。透射电镜观察,未加药组多数细胞被虫体破坏,而NTZ和GAs组虫体结构萎缩,细胞结构基本保持正常。结论:PCR-RFLP技术和基因测序技术均可用于鉴定隐孢子虫虫种,RFLP技术适用于临床检测及流行病学调查,基因测序技术可用于鉴定新种。冻融法+蛋白酶K法+声裂法联合使用能使卵囊DNA的提纯效率达到最大,国产基因组DNA纯化试剂盒和5%异硫氰酸胍裂解法提纯隐孢子虫卵囊DNA可获得与进口试剂盒相近的效果。安氏隐孢子虫可在HCT-8细胞内增殖,培养液中不同添加物对安氏隐孢子虫促增殖作用不尽相同。GAs与NTZ一样具有良好的体外抗隐孢子虫增殖效果,是一种有发展前景的新型抗隐孢子虫药物。